蔡海瑜 劉愛珍 宋芷霜 劉路玖 李幔 劉志超

河南大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院，鄭州市婦幼保健院婦科（鄭州450012）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在15 ～44 歲女性中發(fā)病率高［1］，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，此外，其在發(fā)展中國家的發(fā)病率遠(yuǎn)高于發(fā)達(dá)國家，在中國，每年有超過13 萬女性被確診為宮頸癌，且宮頸癌的發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢［1］。由于宮頸癌患者早期癥狀不明顯，導(dǎo)致診斷存在一定的延后和困難［2］，患者不能及時治療，此外，化療是臨床治療宮頸癌的主要手段之一，但化療治療宮頸癌的有效率只有50%左右，且隨著用藥周期的延長，會出現(xiàn)不同程度的耐藥，進(jìn)而影響化療效果甚至導(dǎo)致治療失?。?］，因此，對宮頸癌的有效抑制及增加化療敏感性始終是該領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)和亟待解決的難點(diǎn)。

近年來，有研究證實(shí)宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒有關(guān)，而雌激素與人乳頭瘤病毒的感染存在一定關(guān)系［3］，因此，筆者猜測雌激素與宮頸癌的發(fā)生是否存在一定聯(lián)系。炎癥相關(guān)基因環(huán)氧合酶-2（COX-2）在慢性炎癥啟動致癌信號通路過程中發(fā)揮重要作用，可促進(jìn)腫瘤的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，COX-2 與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)，本研究旨在研究雌激素對人宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖和化療敏感性的影響，及該影響是否與COX-2 相關(guān)，從而探討雌激素在宮頸癌發(fā)展過程中可能起到的作用及作用機(jī)制，為宮頸癌的臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑人宮頸癌Hela 細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫。含雙抗的1640 培養(yǎng)基，胎牛血清購自美國Gibco 公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK-8試劑盒購自Sigma公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen 公司；COX-2、GAPDH 鼠抗人單克隆抗體購自購自美國Corning Life Sciences公司。

1.2 SiRNA 的構(gòu)建抗人COX-2 SiRNA 由廣州銳博生物公司合成，COX-2SiRNA 序列正義：5′-GCA UUCGAUUCAGCUUCGUtt-3′；反 義：5′-UACGUC GAUCUUACGUACUtt-3′。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)將人宮頸癌Hela 細(xì)胞株解凍復(fù)蘇，用含有10%雙抗及10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液重懸，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部70%以上時，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化、重懸，按1∶3 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取傳代后對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 SiRNA 的轉(zhuǎn)染取對數(shù)期Hela 細(xì)胞將其接種于96 孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為2 × 105個/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照說明書操作要求，用Lipofectamine 2000將含COX-2 Si RNA的質(zhì)粒及空白質(zhì)粒（COX-2 normal control，COX-2 NC）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖能力將培養(yǎng)中的人宮頸癌Hela 細(xì)胞與不同濃度的雌二醇（E2）共培養(yǎng)，共設(shè)置5 個濃度梯度，分別為0、10、50、100、500、1 000 nmol/L，各組分別設(shè)置6 個復(fù)孔，將各組細(xì)胞與E2 共培養(yǎng)48 h 后，向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液，將細(xì)胞在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，用酶標(biāo)儀檢測每孔細(xì)胞懸液在490 nm 波長處的吸光度（A490），以此來表示細(xì)胞的增殖活性。

同樣的方法，將正常Hela 細(xì)胞、轉(zhuǎn)染COX-2 Si RNA和COX-2 NC的細(xì)胞各組分別設(shè)置6個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染48 h 后用CCK-8 法檢測各組細(xì)胞增殖活性。

1.7 化療敏感性檢測將培養(yǎng)中的人宮頸癌Hela細(xì)胞與不同濃度的E2共培養(yǎng)，共設(shè)置5個濃度梯度［5］，分別為0、10、50、100、500、1 000 nmol/L，加入順鉑（0.5 μg/mL），每組設(shè)置6 個復(fù)孔，將各組細(xì)胞與E2 共培養(yǎng)48 h 后，以空白細(xì)胞（即不與藥物共培養(yǎng)的人宮頸癌Hela 細(xì)胞）作為對照組，CCK-8 法檢測各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組A 值/對照組A 值×100%。

將轉(zhuǎn)染COX-2 Si RNA、COX-2 NC 的細(xì)胞與正常組細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，分別加入順鉑（0.5 μg/mL），每組設(shè)置6 個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以空白細(xì)胞作為對照組，同樣的方法檢測細(xì)胞存活率。

1.8 Western blot檢測Hela 細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)將培養(yǎng)中的人宮頸癌Hela 細(xì)胞與不同濃度的E2共培養(yǎng)，共設(shè)置5個濃度梯度［5］，分別為0、10、50、100、500、1 000 nmol/L，加入順鉑（0.5 μg/mL），每組設(shè)置6 個復(fù)孔，將各組細(xì)胞與E2 共培養(yǎng)48 h 后，蛋白裂解液冰浴中裂解，離心取上清液，電泳條件分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉孵育NC 膜，按順序加入一抗、二抗，TBST 洗滌NC 膜，ECL 顯色，將膠片掃描后用Bandscan 5.0 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差分析有差異時，則進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的兩兩比較；計(jì)數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05 則認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E2 能刺激Hela 細(xì)胞增殖用不同濃度的E2與Hela 細(xì)胞共培養(yǎng)，CCK-8 檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，10、50 nmol/L 組與正常組細(xì)胞增殖活性差異無顯著性，100、500、1 000 nmol/L E2 與Hela 細(xì)胞共培養(yǎng)后，增殖活性顯著高于低劑量組（P＜0.05），且增殖活性呈現(xiàn)劑量依賴性增長。見表1。

表1 不同濃度E2 處理后Hela 細(xì)胞增殖活性Tab.1 Hela cell proliferation activity after treatment with different concentrations of E2±s

表1 不同濃度E2 處理后Hela 細(xì)胞增殖活性Tab.1 Hela cell proliferation activity after treatment with different concentrations of E2±s

注：a，與0 nmol/L 組相比，P＜0.05；b，與10 nmol/L 組相比，P＜0.05；c，與50 nmol/L 組相比，P＜0.05；d，與100 nmol/L 組相比，P＜0.05；e，與500 nmol/L 組相比，P＜0.05

組別0 nmol/L 10 nmol/L 50 nmol/L 100 nmol/L 500 nmol/L 1 000 nmol/L樣本量6 6 6 6 6 6 A490 0.420±0.012 0.463±0.016 0.531±0.025 0.963±0.021abc 1.123±0.034abcd 1.422±0.036abcde

2.2 E2 能抑制Hela 細(xì)胞順鉑化療敏感性將不同濃度的E2 與Hela 細(xì)胞和順鉑共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，添加順鉑后細(xì)胞存活率顯著下降，說明Hela 細(xì)胞對順鉑有一定的敏感性；當(dāng)不同濃度的E2 與添加順鉑的Hela 細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)除10 nmol/L 和0 nmol/L 組的細(xì)胞存活率差異無顯著性外，其余各組細(xì)胞存活率均隨著E2 濃度的增加而增加，說明隨著E2 濃度的增加，Hela 細(xì)胞對順鉑的敏感性降低。見表2。

表2 不同濃度E2 處理后Hela 細(xì)胞順鉑化療敏感性Tab.2 Sensitivity of cisplatin to Hela cells treated with E2 at different concentrations ±s

表2 不同濃度E2 處理后Hela 細(xì)胞順鉑化療敏感性Tab.2 Sensitivity of cisplatin to Hela cells treated with E2 at different concentrations ±s

注：a，與Hela 細(xì)胞相比，P ＜0.05；b，與Hela 細(xì)胞+順鉑+0 nmol/L E2 組相比，P ＜0.05；c，與Hela 細(xì)胞+順鉑+10 nmol/L E2 組相比，P ＜0.05；d，與Hela 細(xì)胞+順鉑+50 nmol/L E2組相比，P ＜0.05；e，與Hela 細(xì)胞+順鉑+100 nmol/L E2 組相比，P ＜0.05；f，與Hela 細(xì)胞+順鉑+500 nmol/L E2 組相比，P ＜0.05

組別Hela 細(xì)胞Hela 細(xì)胞+順鉑+E2（0 nmol/L）Hela 細(xì)胞+順鉑+E2（10 nmol/L）Hela 細(xì)胞+順鉑+E2（50 nmol/L）Hela 細(xì)胞+順鉑+E2（100 nmol/L）Hela 細(xì)胞+順鉑+E2（500 nmol/L）Hela 細(xì)胞+順鉑+E2（1000 nmol/L）樣本量6 6 6 6 6 6 6細(xì)胞生存能力（%）100 23.27±2.19a 25.19±3.33a 37.39±5.24abc 51.22±8.21abcd 79.01±7.11abcde 90.91±10.24abcdef

2.3 COX-2基因沉默后Hela細(xì)胞增殖活性降低與正常Hela 細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染COX-2 NC 后的細(xì)胞增殖活性無顯著改變，而轉(zhuǎn)染COX-2 SiRNA 的細(xì)胞增殖率顯著降低（P＜0.05），說明COX-2 基因沉默后Hela 細(xì)胞增殖活性降低。見表3。

表3 轉(zhuǎn)染后Hela 細(xì)胞增殖活性Tab.3 Hela cell proliferation activity after transfection ±s

表3 轉(zhuǎn)染后Hela 細(xì)胞增殖活性Tab.3 Hela cell proliferation activity after transfection ±s

注：a，與Hela 細(xì)胞相比，P ＜0.05；b，與COX-2 SiRNA 轉(zhuǎn)染后Hela 細(xì)胞相比，P ＜0.05

組別Hela 細(xì)胞COX-2 NC 轉(zhuǎn)染后Hela 細(xì)胞COX-2 SiRNA 轉(zhuǎn)染后Hela 細(xì)胞樣本量6 6 6 A490 0.393±0.013 0.388±0.034a 0.172±0.011ab

2.4 COX-2 基因沉默后Hela 細(xì)胞順鉑化療敏感性增加正常Hela 細(xì)胞與順鉑共培養(yǎng)后，存活率顯著下降，說明Hela 細(xì)胞對順鉑有一定的敏感性；轉(zhuǎn)染COX-2 NC 后，細(xì)胞存活率較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯變化（P＞0.05），而轉(zhuǎn)染COX-2 SiRNA 后細(xì)胞存活率顯著下降，說明COX-2 基因沉默后能使Hela細(xì)胞順鉑化療敏感性增加。

2.5 E2 能刺激Hela 細(xì)胞內(nèi)COX-2 蛋白表達(dá)用不同濃度的E2與Hela細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，檢測各組細(xì)胞內(nèi)COX-2 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，10、50 nmol/L組與正常組COX-2表達(dá)水平無顯著差異，100、500、1 000 nmol/L 組細(xì)胞COX-2 表達(dá)顯著高于低劑量組，且表達(dá)水平隨著E2 濃度呈增高趨勢。見圖1。

表4 轉(zhuǎn)染后Hela 細(xì)胞的順鉑化療敏感性Tab.4 Sensitivity of cisplatin to Hela cells after transfection

圖1 COX-2 蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of COX-2 protein

3 討論

雌激素是一類固醇類化合物，在女性生理周期中扮演重要角色，其主要作用是促進(jìn)女性生殖器官的發(fā)育，并維持女性的第二性征。女性體內(nèi)從月經(jīng)初潮至絕經(jīng)期最主要的雌激素為E2［5］。有報(bào)道證實(shí)，在體內(nèi)高雌激素的刺激下，E2 可延長宮頸癌細(xì)胞S 期時間，而使G2/M 期比例下調(diào)［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織內(nèi)E2 水平顯著高于子宮肌瘤組織和正常人群的子宮組織，無論患者是否絕經(jīng)，E2 與宮頸癌的關(guān)聯(lián)都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系［7］。另有研究顯示，在宮頸癌細(xì)胞內(nèi)，E2 能刺激E6/E7 原癌基因的增殖、轉(zhuǎn)錄［8］。LI等［9］研究結(jié)果顯示雌激素對Hela 細(xì)胞有促進(jìn)生長的作用，且隨著激素濃度的增高其促進(jìn)增殖的作用增強(qiáng)，認(rèn)為雌激素對宮頸癌細(xì)胞有促進(jìn)作用。CHEN 等［10］研究結(jié)果亦顯示E2 對Hela 細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，且濃度越大，促進(jìn)作用越強(qiáng)。根據(jù)本研究結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)，低濃度E2 對Hela 細(xì)胞的增殖沒有顯著影響，而高濃度的E2 能刺激Hela 細(xì)胞的增殖，且這種作用呈現(xiàn)劑量依賴性，該結(jié)論與田麗波等的研究結(jié)論一致［10］。同時，筆者檢測了E2對Hela 細(xì)胞化療敏感性的影響，結(jié)果顯示，E2 能顯著降低Hela 細(xì)胞對順鉑的化療敏感性，且隨著E2 濃度的增加，Hela 細(xì)胞對順鉑的敏感性降低，此結(jié)果表明高濃度E2 能促進(jìn)Hela 細(xì)胞的增殖，并抑制其化療敏感性。

COX-2 是調(diào)控花生四烯酸生成的前列腺素，能促進(jìn)血管內(nèi)皮因子的激活，促進(jìn)腫瘤新生微血管的形成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力［11-14］，COX-2 表達(dá)增加亦能增強(qiáng)柱狀上皮細(xì)胞突破基底膜的能力，促進(jìn)了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［15-17］。COX 是參與機(jī)體前列腺素生成的主要限速酶，催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化成各類前列腺素［18］，在正常組織中一般不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到促癌劑、炎性介質(zhì)等刺激后會出現(xiàn)高表達(dá)［19］。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2 在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)異常升高，免疫組化結(jié)果顯示其主要在癌變上皮細(xì)胞及惡性上皮細(xì)胞中表達(dá)，提示COX-2 可能參與宮頸癌的發(fā)生［20］。COX-2 為宮頸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一，與宮頸癌臨床分期、轉(zhuǎn)移、腫瘤生長浸潤等都有密切聯(lián)系，貫穿宮頸癌病變的整個過程［21-23］。有研究顯示，COX-2 SiRNA 抑制COX-2 的表達(dá)后癌細(xì)胞的增殖也相應(yīng)受到抑制［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沉默COX-2 基因時，Hela 細(xì)胞增殖活性降低，順鉑化療敏感性增加，這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致［24］，說明COX-2 的活化能促進(jìn)Hela 細(xì)胞的增殖，而抑制其化療敏感性。

為了進(jìn)一步確認(rèn)E2 對Hela 細(xì)胞增殖活性和化療敏感性的影響與COX-2 之間的關(guān)系，筆者將不同濃度的E2 與Hela 細(xì)胞共培養(yǎng)后，檢測了細(xì)胞內(nèi)COX-2 蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著E2 濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)COX-2 蛋白表達(dá)隨之增加，提示E2 對Hela 細(xì)胞內(nèi)COX-2 的表達(dá)有刺激作用，而E2 對Hela 細(xì)胞增殖的刺激和化療敏感的抑制作用，很可能與刺激COX-2 的表達(dá)有一定關(guān)系，筆者猜測E2 刺激COX-2 后，很可能是啟動了某個與宮頸癌細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路，但其具體作用機(jī)制還需筆者下一步探索和驗(yàn)證。

綜上所述，高濃度E2 能促進(jìn)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖，并抑制其化療敏感性，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)COX-2 的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。