陳賽男 譚迎 肖筱嬋 李乾 吳起 董茂龍

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院（廣州510515）

膿毒癥是由感染引起的可導(dǎo)致多器官損傷的全身炎癥反應(yīng)性綜合征，是重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的最常見原因。膿毒癥所致的急性肝損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，涉及一系列分子和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，包括炎癥，細(xì)胞凋亡和壞死［1］。研究［2-3］表明Toll樣受體（TLR）家族是介導(dǎo)膿毒癥急性肝損傷發(fā)生損傷作用的重要分子機(jī)制之一。Toll樣受體4（TLR4）可通過結(jié)合脂多糖（LPS），激活肝內(nèi)的庫普弗細(xì)胞釋放各種炎癥介質(zhì)，引起肝細(xì)胞的凋亡或壞死，從而導(dǎo)致肝損傷［4-5］。因此，本研究通過建立LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型來研究TLR4基因敲除對(duì)膿毒癥急性肝損傷的影響，并探討其中的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制備雄性C57 小鼠和雄性TLR4基因敲除小鼠各32只，體質(zhì)量為20～25 g，C57小鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，TLR4 基因敲除鼠購于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前均寄養(yǎng)在南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)遵從南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)要求進(jìn)行。將64 只小鼠隨機(jī)均分為普通小鼠對(duì)照組（WT），普通小鼠模型組（WT-LPS），TLR4基因敲除小鼠對(duì)照組（TLR4-/-），TLR4基因敲除小鼠模型組（TLR4-/--LPS）。模型組按LPS（4 mg/kg）予以該組小鼠腹腔內(nèi)注射，對(duì)照組予以等量體積的生理鹽水腹腔注射。給藥6 h 后處死所有小鼠［6］，并進(jìn)行以下所有檢測(cè)。

1.2 主要試劑脂多糖（美國Sigma 公司），蛋白氧化羰基檢測(cè)試劑盒（索萊寶生物科技有限公司），天冬氨酸蛋白水解酶3 活性檢測(cè)試劑盒（貝博生物科技公司），抗GAPDH、BAX 和BCL-2 抗體（CST 公司），GOT（AST）、GPT（ALT）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 一般生理特征檢測(cè)

1.3.1 體質(zhì)量、肝重及肝體比測(cè)定采用ES-500E電子天平對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并記錄，然后取出實(shí)驗(yàn)小鼠的肝組織，對(duì)肝組織稱重并記錄，計(jì)算肝體比（肝體比=肝重/體質(zhì)量）。

1.3.2 肝生化指標(biāo)檢測(cè)無菌條件下，在腹腔注射LPS或生理鹽水6 h后抽取小鼠心臟血液2 mL［6］，在4 ℃，3 000 g 轉(zhuǎn)速的離心機(jī)中離心15 min 后取得血清樣品，按試劑盒操作說明書將血清樣品加入96 孔板中，室溫放置15 min，然后用酶標(biāo)儀測(cè)量510 nm處的OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得AST/GOT、ALT/GPT 活力單位。

1.3.3 肝臟HE 染色無菌條件下取新鮮右葉肝組織2 g，PBS 清洗，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約4 μm，行HE 染色，熒光倒置顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。參照SUZUKI 等［7］的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肝臟組織學(xué)評(píng)分。

1.3.4 蛋白氧化羰基檢測(cè)用蛋白氧化羰基檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝組織中氧化羰基蛋白水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.5 Caspase3 活性檢測(cè)用Caspase3 活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肝組織中Caspase3 活性水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 Western Blot 檢測(cè)將500 mg 肝組織在1×RIPA 裂解緩沖液中充分勻漿并在4 ℃下以12 000 r/min 離心15 min。采用BCA 蛋白測(cè)定法用于測(cè)量上清液中的蛋白質(zhì)濃度。定量為50 μg的蛋白質(zhì)上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE 凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，經(jīng)牛奶封閉后分別加入兔抗小鼠Bcl-2 抗體（1∶1 000），BAX 抗體（1∶1 000）以及GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃過夜，取出PVDF 膜后用TBST 漂洗3 次，每次15 min，然后分別加入山羊抗兔型IgG（1∶10 000）在室溫下孵育1 h。洗膜后進(jìn)行顯影，測(cè)定其灰度值，并用對(duì)應(yīng)的GAPDH 條帶強(qiáng)度對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行歸一化，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度=目的蛋白的吸光度值/GAPDH 的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料表示為（）。 數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布及方差齊性，行單因素方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般生理特征與肝功能比較與WT 組相比，WT-LPS 組小鼠的肝重和肝體比以及血漿ALT、AST 均顯著升高（P＜0.05），TLR4-/--LPS 組較WTLPS 組明顯降低（P＜0.05），WT 組與TLR4-/-差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4組小鼠體質(zhì)量、肝重和肝體比以及肝生化指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，BW/LW and biochemical biomarkers of mice in 4 groups ±s

表1 4組小鼠體質(zhì)量、肝重和肝體比以及肝生化指標(biāo)比較Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，BW/LW and biochemical biomarkers of mice in 4 groups ±s

注：與WT 組比較，*P ＜0.05；與WT-LPS 組比較，#P ＜0.05

組別體質(zhì)量（g）肝重（g）肝體比（mg/g）AST（UI/L）ALT（UI/L）WT 組22.70±0.50 1.32±0.02 58.10±1.30 24.30±6.87 28.90±9.26 WT-LPS 組22.90±0.80 1.57±0.03*68.40±1.40*189.25±25.16**215.98±27.99**TLR4-/-組23.10±0.20 1.33±0.03 57.50±1.40 16.24±5.05 24.39±7.40 TLR4-/--LPS 組23.60±0.40 1.43±0.04#60.60±1.20#88.44±23.99##88.19±30.42##

2.2 肝臟病理檢查結(jié)果分析WT組小鼠肝臟基本正常（圖1A）。WT-LPS 組小鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂，體積增大伴炎性浸潤，肝組織內(nèi)可見明顯點(diǎn)灶狀壞死（圖1B）。TLR4-/--LPS 組小鼠肝臟細(xì)胞壞死病灶縮小，脂肪空泡和炎性細(xì)胞浸潤減少（圖1C、D）。與WT組相比，WT-LPS 組病理分?jǐn)?shù)顯著增高（P＜0.01），WT 組與TLR4-/-差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而TLR4-/--LPS組較WT-LPS組降低（P＜0.05，圖1E）。

圖1 4 組小鼠的肝組織形態(tài)學(xué)比較（HE 染色）Fig.1 Comparison of liver histomorphology in 4 groups of mice（HE staining）

2.3 蛋白氧化羰基檢測(cè)和Caspase3 活性檢測(cè)結(jié)果分析與WT 相比，WT-LPS 組小鼠肝組織中的蛋白氧化羰基含量和Caspase3 活性水平明顯增高（P＜0.05），而TLR4-/--LPS 組較WT-LPS 組顯著降低（P＜0.05，圖2、3）。

圖2 4 組小鼠的肝臟組織蛋白氧化羰基含量比較Fig.2 Comparison of carbonyl proteins of liver tissue in 4 groups of mice

圖3 4 組小鼠的肝臟組織Caspase-3 活性水平比較Fig.3 Comparison of caspase3 activity of liver tissue in 4 groups of mice

2.4 凋亡相關(guān)分子BCL-2 和BAX 的表達(dá)比較與WT 組相比，WT-LPS 組小鼠的BCL-2 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），相反，其BAX 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；而與WT-LPS 組對(duì)比，TLR4-/--LPS 組小鼠的BCL-2 表達(dá)升高（P＜0.05）。相反，其BAX 表達(dá)降低（P＜0.05，圖4、5）。

3 討論

隨著臨床診療技術(shù)的不斷發(fā)展，重癥患者的治愈率得到了很大提高，但感染所引起的全身多器官衰竭即膿毒癥（Sepsis）仍然是造成重癥患者死亡的重要原因。肝臟作為人體免疫、代謝、解毒等重要功能的器官，是膿毒癥早期易侵及損傷的器官之一［8-9］。眾所周知，TLR4 是固有免疫中炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵因素［10］。本研究成功運(yùn)用LPS 建立膿毒癥急性肝損傷模型，并首次使用TLR4 基因敲除小鼠來觀察TLR4 在膿毒癥急性肝損傷中產(chǎn)生的作用。結(jié)果顯示野生型LPS 組小鼠肝損傷表現(xiàn)明顯；與WT-LPS 組比較，TLR4-/--LPS 組小鼠肝損傷減輕，Caspase3 活性和氧化羰基水平下降，凋亡蛋白標(biāo)志物表達(dá)比值下降。

圖4 4 組小鼠的肝臟組織BCL-2 表達(dá)的結(jié)果（Western Blot檢測(cè)）Fig.4 BCL-2 expression of liver tissue in 4 groups of mice(Western Blot assay)

圖5 4 組小鼠的肝臟組織BAX 表達(dá)的結(jié)果（Western Blot 檢測(cè)）Fig.5 Bax expression of liver tissue in 4 groups of mice（Western Blot assay）

TLR4 通過與脂多糖結(jié)合可以識(shí)別外源病原體，刺激抗菌肽的產(chǎn)生并誘導(dǎo)非特異性免疫反應(yīng)［11-12］。膿毒癥時(shí)內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)后識(shí)別Toll 樣受體，從而啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，繼而刺激血管內(nèi)皮系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，并激活下游通路釋放多種炎性反應(yīng)因子，形成瀑布式反應(yīng)，使得組織凋亡增加，最終導(dǎo)致肝臟甚至全身多器官功能損傷［13］。最近的研究已證實(shí)TLR4的抗體，抑制劑、拮抗劑或基因敲除會(huì)影響其乙?；?，二聚化以及上游配體的識(shí)別，也可能會(huì)抑制下游信號(hào)的激活，從而影響細(xì)胞功能［14］。也有研究表明可以通過抑制肺組織中TLR4 下游信號(hào)分子NF-κB 信號(hào)通路的異常激活來減輕LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥反應(yīng)和損傷［15］。本研究在肝臟HE 染色中觀察到WT-LPS 組大量肝細(xì)胞變性，而TLR4-/--LPS 組肝細(xì)胞變性減輕中，這提示TLR4 基因敲除可以減輕LPS引起的急性肝損傷。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，是機(jī)體維持自身穩(wěn)定的一種基本生理機(jī)制。細(xì)胞凋亡的發(fā)生有賴于相關(guān)基因的表達(dá)和蛋白質(zhì)的合成。膿毒癥時(shí)內(nèi)毒素首先刺激肝庫普弗細(xì)胞分泌TNF-α，再通過其下游多條信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)將凋亡信號(hào)傳遞至Caspase3 并使其活化，最終誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡［16］。細(xì)胞凋亡是由多種因子或蛋白參與的復(fù)雜的病理生理過程，其中抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl 等）與促凋亡蛋白（如Bax、Caspase3 等）相互作用失衡尤為重要［17-19］。在LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥急性肝損傷模型中，經(jīng)典的TLR4/MyD88/NF-κB 通路可通過刺激炎癥因子的釋放導(dǎo)致細(xì)胞和組織的凋亡和壞死增多，從而發(fā)揮組織損傷作用［20］。本研究結(jié)果顯示，對(duì)比WT 組，WT-LPS 組小鼠肝組織中的Caspase3活性增高以及Bax 表達(dá)增高，而Bcl-2 表達(dá)降低；TLR4-/--LPS 組小鼠的Caspase3 活性水平和Bax 較WT-LPS 組降低，Bcl-2 表達(dá)增高，這提示LPS 可誘導(dǎo)凋亡，而TLR4 基因敲除可能通過抑制凋亡通路的激活來減輕LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠肝臟的損傷。

綜上，本研究首次證實(shí)了TLR4 敲除可以通過抑制凋亡減輕LPS 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠急性肝損傷，為靶向干預(yù)TLR4 基因治療膿毒癥急性肝損傷提供了有力的依據(jù)，亦為深入探討膿毒癥急性肝損傷的疾病發(fā)展提供了參考。但本課題組對(duì)TLR4 基因敲除后通過何種信號(hào)通路抑制凋亡尚未明確，因而，深入研究相關(guān)的分子機(jī)制是本課題組接下來著重的研究方向。