吳曉戀， 傅稼耀， 武文婧， 謝培進， 吳珺華

（上海牙組織修復(fù)與再生工程技術(shù)研究中心，同濟大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·同濟大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔修復(fù)教研室，上海200072）

口腔頜面部外傷、腫瘤或拔牙后牙槽骨吸收等都會造成頜骨骨缺損，目前主要通過自體或異體骨移植、骨引導(dǎo)再生技術(shù)等進一步修復(fù)，但仍有一定的局限性。 骨髓間充質(zhì)干細胞 （bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs） 因其具有多向分化潛能，可促進骨缺損修復(fù)[1-2]，是組織工程技術(shù)中的關(guān)鍵；但因BMSCs 自身存在衰老問題[3]，有研究證明老齡化機體的BMSCs 成骨分化能力大大降低[4]，可能是老齡化患者骨再生修復(fù)緩慢的原因之一。

外泌體（exosome）作為一種細胞間信息傳遞的生物活性物質(zhì)， 近年來成為科學(xué)研究的前沿和熱點，BMSCs 是分泌外泌體能力最強的細胞之一。BMSCs 來源的外泌體（BMSCs-exo）具有與BMSCs 相似的多種生物學(xué)功能，其內(nèi)含有近50 種miRNAs，已被證實廣泛參與了細胞生物學(xué)中多種生理機制的調(diào)控[5]。 BMSCs 來源的外泌體具有與BMSCs 相似的多種生物學(xué)功能，如減輕心肌缺血和再灌注損傷[6]，減輕腎臟損傷[7]，參與免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)[8]，調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]，治療神經(jīng)系統(tǒng)性疾病[10]，改善骨質(zhì)疏松癥[11]，促進軟骨修復(fù)[12]等。 而且BMSCs 分泌的外泌體不僅能作用于周圍的細胞進行組織修復(fù)， 還能特異性地識別BMSCs，起到自我調(diào)節(jié)作用。

衰老細胞不僅自身功能減退，有研究發(fā)現(xiàn)衰老的細胞還會分泌大量的生物因子， 在其周圍形成衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）， 誘導(dǎo)周圍組織出現(xiàn)連鎖反饋[13]；但關(guān)于外泌體在BMSCs 衰老過程中的作用， 鮮見報道。 本文擬對年輕小鼠來源外泌體對老齡小鼠BMSCs 衰老的作用及機制進行初步探索，為老齡患者頜骨缺損修復(fù)時外泌體的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL/6 小鼠由上海斯萊克動物實驗有限公司提供，飼養(yǎng)于同濟大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2 實驗試劑 無外泌體血清（EXOFBS50A-1，BI 公司， 美國）， 外泌體提取試劑盒（4478359，Life公司， 美國），PKH67 熒光染色劑 （Sigma 公司，美國），總RNA 提取試劑盒（Invitrogen 公司，美國），衰老細胞β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天公司，中國）。 細胞轉(zhuǎn)染試劑盒，miR-199a-3p mimics，miR-214-3p mimics，miR mimics 陰性對照 （廣州銳博生物科技有限公司，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠BMSCs來源外泌體的分離、提純及鑒定 將3～4 周齡的小鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇浸泡10 min；無菌條件下取出股骨及脛骨，去凈軟組織，剪去長骨兩端，暴露骨髓腔，用1 mL 注射器吸取含10%胎牛血清、1×雙抗的α-MEM 培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)； 培養(yǎng)3 d 后換液， 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗2 遍后，加入8～10 mL 完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；當(dāng)細胞融合度達80%時傳代，培養(yǎng)至P3 代， 待細胞融合至70%左右時， 將培養(yǎng)基換成10%無外泌體血清+1×雙抗+α-MEM 培養(yǎng)基； 培養(yǎng)3 d 后收集細胞培養(yǎng)基，于4 ℃下400×g 離心15 min，進行2 次以去除培養(yǎng)基中的細胞碎片；于4 ℃下5 000×g 離心15 min，進行2 次以去除培養(yǎng)基中的凋亡小體等，棄沉淀物，收集上清液；在上清液中加入1/2 體積的外泌體提取試劑，上下顛倒充分混勻，置于4 ℃靜置，孵育12～16 h；將混合液分裝，于4 ℃下10 000×g 離心120 min，棄上清液，沉淀部分即為分離的外泌體。 經(jīng)透射電鏡掃描、粒徑檢測及流式細胞儀表面標(biāo)記物檢測，進一步鑒定分離、提純的物質(zhì)。

1.2.2 PKH67 熒光標(biāo)記外泌體 將PKH67 原液按1∶500 比例稀釋，取500 μL 稀釋后的PKH67 染料，加入至用試劑盒提取獲得的外泌體中，加樣器輕柔混勻，25 ℃下孵育2～5 min，以加入同樣染料的PBS作為對照組。 孵育后加入等體積的1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液1 min，作為終止液，終止染色反應(yīng)。將PBS 加入超濾管內(nèi)至30 mL，用試劑盒提取外泌體，重復(fù)1 次，對照組做相同處理，離心后用PBS 重懸，備用。 將PKH67 染色后的外泌體按照1 μg/mL 的濃度加入衰老小鼠BMSCs 中作為實驗組（BMSCs+外泌體），將PKH67 染色后的等體積PBS 加入衰老小鼠BMSCs 中作為對照組（BMSCs+PBS），培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、6、12 h。PBS 沖洗2 次，加入4%多聚甲醛固定30 min。 PBS 沖洗2 次后，用DAPI 熒光染料將細胞核染色。 用抗熒光淬滅劑封片，避光保存。 通過熒光顯微鏡獲得圖像。

1.2.3 年輕小鼠BMSCs來源外泌體作用于老齡小鼠BMSCs衰老情況的檢測 提取老齡小鼠BMSCs培養(yǎng)至P3 代，制備為細胞懸液，計數(shù)后以1×108個/mL 的密度接種在60 mm 培養(yǎng)皿中； 將提取的年輕小鼠BMSCs 來源的外泌體按10 μg/mL 的濃度加入10%無外泌體血清和1×雙抗及α-MEM 配制成的完全培養(yǎng)基中，使用等量PBS 加入10%無外泌體血清和1×雙抗及α-MEM 配制成的完全培養(yǎng)基作為陰性對照。 細胞接種次日，去除原培養(yǎng)液，PBS 洗2 遍，將以上2 組培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿中， 放進培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d， 分別進行CCK-8 檢測、 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測及β-半乳糖苷酶染色分析。

1.2.4 年輕小鼠和老齡小鼠BMSCs來源的外泌體基因芯片檢測 分別提取年輕小鼠及老齡小鼠BMSCs 來源的外泌體， 加入等體積TRIzol 裂解液裂解30 min，然后加入1/5 體積的三氯甲烷，上下劇烈顛倒混勻，靜置1 min；于4 ℃下12 000×g 離心15 min，轉(zhuǎn)移上層的無色水相層液體至新的離心管中，加入等體積無水乙醇（勿觸碰沉淀物），輕輕上下顛倒混勻，移至RNA 取管中；于4 ℃下12 000 × g離心15 min，按照說明書，依次加入試劑盒中的緩沖液，加15 μL 的RNase-free 水，溶解RNA。 RNA濃度及純度測定:取1 μL 總RNA 加到Nanodrop 載物臺上，讀取總RNA 濃度，以及260 nm/280 nm 吸收值的比值，2.0 左右被認為純度較高; 取1 μL 總RNA 備用， 采用Agilent 2100 分析儀進行生物芯片分析，并將濃度、純度較高的RNA 樣品（外泌體及其分泌細胞）交由北京百邁克生物有限公司進行質(zhì)譜分析，并根據(jù)分析結(jié)果，選取差異性表達最大的2個miRNAs（miR-199a-3p、miR-214-3p）進行后續(xù) 實驗。

1.2.5 分別轉(zhuǎn)染miR-199a-3p-mimics和miR-214-3p-mimnics至老齡小鼠BMSCs中以觀察衰老狀況的改變 將1×105個/mL 濃度的BMSCs 接種至60 mm的培養(yǎng)皿中， 采用10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)， 每皿4 mL， 放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4 h后，取出培養(yǎng)皿，顯微鏡下確認細胞貼壁且狀態(tài)良好，去除培養(yǎng)基并用PBS 清洗，配制轉(zhuǎn)染液：分別添加miR-199a-3p mimics、miR-214-3p mimics，配制成過表達的轉(zhuǎn)染液， 其余各組添加隨機序列的對照mimics；分別將轉(zhuǎn)染液添加至培養(yǎng)皿中，每皿4 mL，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；轉(zhuǎn)染24 h 后，取出培養(yǎng)皿，去除培養(yǎng)液后PBS 清洗，換成正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d 后分別進行qPCR 檢測、CCK-8 檢測及β-半乳糖苷酶染色分析。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22 軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間差異比較用one-way ANOVA 分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 組間差異比較用獨立樣本t檢驗分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 小鼠BMSCs 來源外泌體的鑒定

圖1 外泌體鑒定Figure 1 Identification of exosomes

外泌體鑒定方式主要有電鏡檢測、 粒徑檢測、表面標(biāo)志蛋白檢測等（圖1）。 透射電鏡掃描下觀察到囊泡為納米級囊泡，囊泡復(fù)染后呈深色，直徑在20～200 nm（圖1A）；經(jīng)粒徑測量分析所得，囊泡直徑均值為146.4 nm，粒徑主峰為130.2 nm，直徑在20～200 nm 的囊泡百分比為98%（圖1B）；流式細胞儀檢測囊泡表面標(biāo)志蛋白CD63 和CD81。 結(jié)果顯示， 經(jīng)染色后得到的外泌體表面標(biāo)志蛋白均呈陽性，陽性率在70%以上（圖1C～F）。 上述結(jié)果表明，小鼠BMSCs 培養(yǎng)基中分離得到的細胞外囊泡為外泌體。

2.2 老齡小鼠BMSCs 特異性攝取年輕小鼠BMSCs來源的外泌體

將年輕小鼠BMSCs 來源外泌體添加至老齡小鼠BMSCs 的完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 h 后，顯微鏡下觀察到老齡小鼠的BMSCs 內(nèi)開始出現(xiàn)綠色熒光，12 h后，熒光強度顯著性增加，幾乎所有細胞內(nèi)都能觀察到綠色熒光標(biāo)記的外泌體，而在對照組的BMSCs中沒有出現(xiàn)綠色熒光信號（圖2）。結(jié)果表明，年輕小鼠BMSCs 來源外泌體以時間依賴性方式被老齡小鼠的BMSCs 特異性攝取。

圖2 外泌體綠色熒光標(biāo)記表達情況Figure 2 Expression of green fluorescent markers in exosomes

2.3 年輕小鼠BMSCs 來源外泌體對衰老BMSCs的影響

將年輕小鼠BMSCs 來源外泌體加入老齡小鼠BMSCs 的完全培養(yǎng)基中，3 d 后進行CCK-8 檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)年輕小鼠BMSCs 來源外泌體作用后的老齡小鼠BMSCs 的增殖能力，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3A）；qPCR 檢測結(jié)果顯示，經(jīng)年輕小鼠BMSCs 來源外泌體作用后的老齡小鼠BMSCs 中衰老基因表達明顯下降， 與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3B）；β-半乳糖苷酶染色結(jié)果顯示， 經(jīng)年輕小鼠BMSCs 來源外泌體作用后，BMSCs 衰老細胞數(shù)量明顯減少（圖3C～D）。以上實驗結(jié)果說明，年輕小鼠BMSCs 來源的外泌體可有效緩解BMSCs 的衰老狀態(tài)。

2.4 年輕小鼠BMSCs 來源外泌體和老齡小鼠BMSCs來源外泌體的基因芯片分析結(jié)果

我們分別提取了年輕小鼠的BMSCs 來源外泌體（S01）和老齡小鼠的BMSCs 來源外泌體（S02）進行外泌體的基因芯片分析，比較2 組樣本間存在差異性表達的miRNAs， 篩選出了2 個表達量較高且表達差異明顯的miRNAs， 即miR-199a-3p 及miR-214-3p， 進一步探究這2 個miRNAs 在老齡BMSCs的衰老過程中可能起到的作用（圖4）。

2.5 MiR-199a-3p、miR-214-3p 對 老 齡 小 鼠 來 源BMSCs 衰老的影響

圖3 年輕小鼠BMSCs 來源外泌體對衰老BMSCs 的影響Figure 3 Effect of young mice BMSCs-exosome on aging BMSCs

根據(jù)“2.4”的結(jié)果，我們進一步改變老齡小鼠BMSCs 細胞內(nèi)2 個miRNAs 的表達量， 初步探究miR-199a-3p、miR-214-3p 對老齡小鼠BMSCs 衰老的影響。 利用miR-199a-3p mimics 和miR-214-3p mimics 分別轉(zhuǎn)染老齡小鼠來源的BMSCs 后的CCK-8 檢測結(jié)果顯示：老齡小鼠的BMSCs 內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics 后，OD值明顯高于對照組，衰老相關(guān)基因p16、p53表達也明顯下降， 與對照組相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明miR-199a-3p可能參與了BMSCs 衰老過程的調(diào)節(jié)；而老齡小鼠BMSCs 內(nèi) 轉(zhuǎn) 染miR-214-3p mimics 后，OD值 及qPCR 數(shù)據(jù)與對照組相比較，沒有明顯差異，說明老齡小鼠來源的BMSCs 內(nèi)miR-214-3p 含量的增加可能對細胞衰老沒有明顯的影響（圖5）。

圖4 BMSCs 來源外泌體miRNAs 熱圖Figure 4 MiRNAs thermogram of exosomes from BMSCs

3 討論

衰老是一種普遍存在于生物系統(tǒng)中的退行性過程， 伴隨著不可逆的退行性變化和不斷增加的疾病敏感性，最終造成死亡[14]。 衰老是人類健康不得不面臨的重要問題， 衰老的細胞會分泌一些信號分子，引起各種衰老相關(guān)性疾病的發(fā)生， 威脅著人類的生命健康。隨著年齡的不斷增長，機體在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能等方面必然會出現(xiàn)一系列全身性的、多方面的退行性變化，如骨質(zhì)丟失、骨質(zhì)疏松、骨髓再生能力減弱、機體自我修復(fù)功能下降等。 臨床上老齡患者因外傷、腫瘤等導(dǎo)致的頜骨缺損，運用常規(guī)的骨移植、骨引導(dǎo)再生技術(shù)進行修復(fù)時， 因老齡化機體存在的全身性、退行性變化，使修復(fù)存在一些局限性。 因此，尋找一個既能抗衰老又能促進頜骨修復(fù)的治療方法，具有重要的臨床意義。

細胞衰老是指因各種因素而使細胞停滯于G0/G1 期， 無法進入S 期啟動染色體復(fù)制以完成增殖活動的生理過程[15]。 BMSCs 一旦發(fā)生衰老，其成骨分化的能力也將大大降低。 本文研究發(fā)現(xiàn)， 經(jīng)年輕小鼠BMSCs 來源外泌體作用后的老齡小鼠BMSCs， 增殖能力較對照組明顯增強， 細胞有繼續(xù)增殖分化的現(xiàn)象，說明年輕小鼠BMSCs 來源外泌體具有緩解老齡小鼠BMSCs 衰老的作用， 甚至可以說年輕小鼠BMSCs來源的外泌體可以逆轉(zhuǎn)老齡小鼠BMSCs 的衰老狀態(tài)，使衰老的BMSCs 重新開始分化、增殖。

圖5 MiR-199a-3p、miR-214-3p 對老齡小鼠來源的BMSCs 衰老的影響Figure 5 The effect of miR-199a-3p and miR-214-3p on the aging process of BMSCs from old mice

外泌體是細胞在生理或病理狀態(tài)下分泌的、大小約40～100 nm 的同質(zhì)性囊泡[16]。 囊泡內(nèi)含豐富的生物活性物質(zhì)，它不僅易與鄰近細胞膜發(fā)生融合，還有部分外泌體能循環(huán)進入體內(nèi)作用于全身系統(tǒng)，由內(nèi)分泌途徑被吸收，將生物活性物質(zhì)選擇性地呈遞給受體細胞，調(diào)節(jié)細胞間的信號傳導(dǎo)，發(fā)揮生物學(xué)功能[17]。 由于外泌體的諸多優(yōu)點，如良好的耐受性，所載藥物在體內(nèi)可保持一個較長的循環(huán)半衰期從而提高療效； 能穿過細胞膜將承載物質(zhì)運送至靶細胞；特有的定向歸巢能力，并能進行膜修飾從而增強細胞特異性靶向作用；在體內(nèi)、體外均能加載藥物等。 有關(guān)外泌體載藥治療的研究在近幾年取得了巨大的進展[18]，目前，在心血管疾病[19]、系統(tǒng)性神經(jīng)性疾病[20]、免疫性疾病[21]、腫瘤[22-23]等方面均有廣泛的外泌體載藥或外泌體載miRNA 基因治療的臨床研究報道。 本文研究發(fā)現(xiàn)，隨著小鼠的增齡性變化，BMSCs 來源外泌體內(nèi)miR-199a-3p、miR-214-3p 的基因表達量也發(fā)生了顯著性改變， 增加BMSCs 細胞內(nèi)2 個miRNAs 的表達量后，我們發(fā)現(xiàn)增加miR-199a-3p 基因表達可明顯緩解BMSCs 的衰老過程。外泌體內(nèi)含有大量來源細胞的miRNA、 蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、信號分子等生物活性物質(zhì)。 結(jié)合以上實驗結(jié)論，我們可以推測，BMSCs 來源外泌體內(nèi)的miR-199a-3p 極有可能在BMSCs 衰老過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，但具體機制有待進一步的研究。

綜上所述，本文研究結(jié)果提示年輕小鼠BMSCs來源的外泌體具有緩解老齡小鼠BMSCs 衰老的作用，探究外泌體及其所含miRNA 在BMSCs 衰老過程中的作用機制，將會為未來運用BMSCs 來源外泌體載miRNA 修復(fù)老齡患者頜骨缺損提供理論依據(jù)。