陸玖青， 呂佳姝， 謝亞佳， 甄 蕾

（1． 復(fù)旦大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，上海市口腔病防治院牙周科；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，上海市口腔病防治院口腔內(nèi)科；3. 復(fù)旦大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔生物醫(yī)學(xué)工程實(shí)驗(yàn)室，上海 200001）

糖尿病（diabetes mellitus， DM）是一種以高血糖為特征的危害人體健康的全身性疾病，常伴有骨代謝異常，引起繼發(fā)性骨量減少和骨質(zhì)疏松等糖尿病性骨病。 研究顯示，糖尿病患者發(fā)生牙周炎和進(jìn)行性牙槽骨吸收的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高[1-2]，進(jìn)而導(dǎo)致牙齒松動(dòng)脫落， 給牙槽骨缺損修復(fù)和種植修復(fù)帶來困難。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，與長骨來源的BMSCs 相比，頜骨來源的BMSCs 具有取材方便、 成骨分化能力強(qiáng)等特點(diǎn)[3]，逐漸成為口腔骨缺損修復(fù)的重要種子細(xì)胞。 但是糖尿病對(duì)頜骨BMSCs 生物學(xué)特性的影響及機(jī)制，目前還未完全闡明。 本研究旨在分析糖尿病對(duì)大鼠頜骨結(jié)構(gòu)和頜骨來源BMSCs 成骨分化能力的影響，并初步探討其可能的機(jī)制，為糖尿病患者牙槽骨缺損修復(fù)和種植修復(fù)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國），胎牛血清（Gibco 公司，美國），青鏈霉素（Gibco 公司，美國），胰酶（Gibco 公司，美國）；鏈脲佐菌素（Sigma 公司，美國），抗壞血酸（Sigma 公司，美國），β-甘油磷酸鈉（Sigma 公司，美國），地塞米松（Sigma 公司，美國），茜素紅S（Sigma 公司，美國），十六烷基吡啶（Sigma公司，美國）；CCK-8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)，ALP 染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)，ALP 活性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)，BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)，細(xì)胞核蛋白、漿蛋白抽提試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），ECL 顯色液（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），羊抗兔二抗（碧云天生物技術(shù)有限公司，中國）；TRIzol 試劑（Tiangen 公司，中國），cDNA 第一鏈合成試劑盒（Tiangen 公司，中國），熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒（Tiangen 公司，中國）；NF-κB p65 核蛋白（CST 公司，美國），HDAC1 單克隆抗體（CST 公司，美國）。

CO2培養(yǎng)箱，超微量核酸蛋白定量儀（Thermo 公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國）；全波長多功能酶標(biāo)儀（Biotek 公司，美國）；熒光定量PCR 儀（Roche 公司，美國）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與建模 SPF 級(jí)6 周齡SD 雄性大鼠12 只，體重（200±10） g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0004。所有大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組和糖尿病組，禁食、不禁水12 h，糖尿病組大鼠腹腔一次性注射新鮮配制的鏈脲佐菌素（65 mg/kg），對(duì)照組大鼠腹腔注射等量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。分別于注射后3、7 d 時(shí)，所有大鼠禁食12 h 后尾靜脈采血測(cè)量空腹血糖值，以2 次血糖值均＞16.7 mmol/L 視為糖尿病建模成功。 建模成功后，2 組大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)8 周，每周監(jiān)測(cè)血糖。

1.2.2 Micro-CT掃描 糖尿病建模成功8 周后，所有大鼠用戊巴比妥鈉麻醉，頸椎脫臼處死。 分離上、下頜骨，上頜骨徹底剝離軟組織后用4%多聚甲醛固定1 周，micro-CT 掃描，三維圖像重建。 取上頜第一磨牙根分叉區(qū)域行骨小梁形態(tài)分析，測(cè)量分析骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁間隙（Tb.Sp）等骨形態(tài)學(xué)參數(shù)。分別取第一磨牙和第二磨牙的頰、近頰、遠(yuǎn)頰、腭、近腭、遠(yuǎn)腭6 個(gè)位點(diǎn)，測(cè)量牙槽嵴頂至釉牙骨質(zhì)界的距離，計(jì)算牙槽骨吸收。

1.2.3 頜骨BMSCs原代培養(yǎng) 將“1.2.2”中分離得到的正常對(duì)照組和糖尿病組大鼠下頜骨浸泡在75%乙醇溶液中，迅速轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)；用消毒好的器械將下頜骨上的肌肉、 筋膜等結(jié)締組織剔除干凈，于含1%青鏈霉素的PBS 中沖洗2 遍； 用咬骨剪將下頜骨的上、下兩端剪開，用5 mL 無菌注射器吸取α-MEM 溶液，反復(fù)沖洗至骨髓腔發(fā)白;沖洗液吸入離心管內(nèi)，1 500 r/min 離心5 min。 棄上清液，用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的α-MEM 以1×106個(gè)/mL 的密度接種于10 cm 培養(yǎng)皿中， 置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h 后換液， 之后每3 d換液1 次，直至細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取正常對(duì)照組和糖尿病組細(xì)胞， 按2 000 個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。 于培養(yǎng)的第1~7 天，每孔加入10 μL CCK-8 工作溶液，37 ℃下孵育2 h， 每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)定吸光度值，繪制增殖曲線。

1.2.5 ALP 染色和活性測(cè)定 取正常對(duì)照組和糖尿病組細(xì)胞，按以1×105個(gè)/mL 的密度接種于12 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)48 h 后更換為含100 μg/mL 抗壞血酸、2 mmol/L β-甘油磷酸鈉和10 nmol/L 地塞米松的成骨誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d。 ALP 染色：棄去原培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定10 min， 每孔加入500 μL BCIP/NBT 染色液，室溫避光孵育15 min，PBS 清洗后拍照。 ALP 活性測(cè)定： 棄去原培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，每孔細(xì)胞加入500 μL 細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。 每孔吸取50 μL 加入96 孔板中，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組和標(biāo)準(zhǔn)品組，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔。 加入50 μL 顯色液37 ℃孵育10 min，加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)定吸光度值， 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ALP 表達(dá)量。

1.2.6 茜素紅染色和定量檢測(cè) 取正常對(duì)照組和糖尿病組細(xì)胞， 按2×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板中， 常規(guī)培養(yǎng)48 h 后更換為成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)21 d。 茜素紅染色： 棄去原培養(yǎng)液，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定10 min，1%茜素紅染液染色5 min，PBS 清洗后拍照。 茜素紅定量檢測(cè)：拍照后的樣本每孔中加入1 mL 2%十六烷基吡啶洗脫茜素紅染料10 min，分別吸取200 μL 洗脫液置于96 孔板中，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，酶標(biāo)儀570 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.2.7 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨相關(guān)基因表達(dá) 取正常對(duì)照組和糖尿病組細(xì)胞， 按2×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)48 h 后更換為成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)7 d。 培養(yǎng)結(jié)束后，PBS 清洗3 次，每孔加入1 mL TRIzol 試劑裂解細(xì)胞，提取總RNA，超微量核酸蛋白定量儀測(cè)定RNA 濃度。cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 以GAPDH 為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)2 組細(xì)胞中成骨相關(guān)基因Runx2和OCN的mRNA 表達(dá)水平。 擴(kuò)增引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.8 Western blot 檢測(cè)NF-κB p65核蛋白表達(dá) 取正常對(duì)照組和糖尿病組細(xì)胞， 按2×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔板中，常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，離心收集細(xì)胞，按細(xì)胞核蛋白、漿蛋白抽提試劑盒說明提取核蛋白，BCA 法測(cè)定細(xì)胞蛋白濃度。 各孔取10 μg 蛋白上樣，5%~12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行蛋白分離，電轉(zhuǎn)膜至預(yù)處理的PVDF 膜。 加入5%脫脂奶粉置室溫封閉1 h。 TBST 洗膜3 次，每次10 min，分別加入一抗，4 ℃下孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗， 室溫孵育1 h。 TBST 緩沖液洗膜3 次，ECL 發(fā)光法顯影。 Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。 核蛋白以HDAC1 為內(nèi)參，NF-κB p65 蛋白與內(nèi)參比值代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖監(jiān)測(cè)

所有大鼠建模前空腹血糖均在5 mmol/L 左右，隨機(jī)抽取6 只建立糖尿病大鼠模型。 如圖1 所示，1 周后血糖監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示， 糖尿病組的6 只大鼠均建模成功， 空腹血糖持續(xù)穩(wěn)定在25 mmol/L 以上，并維持8 周；正常對(duì)照組大鼠空腹血糖穩(wěn)定在5 mmol/L 左右。

圖1 大鼠血糖測(cè)定Figure 1 The concentration of blood glucose in rats

2.2 2 組大鼠牙槽骨吸收和頜骨骨形態(tài)參數(shù)比較

Micro-CT 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠牙槽骨吸收增加， 頜骨骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）降低，骨小梁數(shù)目(Tb.N)減少，骨小梁間隙(Tb.Sp)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

2.3 2 組大鼠細(xì)胞增殖能力比較

CCK-8 結(jié)果顯示，2 組大鼠細(xì)胞在第1 天和第2 天時(shí)的增殖能力未見明顯差異，但從第3 天開始，正常對(duì)照組細(xì)胞增殖能力顯著高于糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

2.4 2 組細(xì)胞ALP 活性比較

2 組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)7 d 后，ALP 染色結(jié)果顯示，糖尿病組細(xì)胞紫色結(jié)晶明顯少于正常對(duì)照組（圖4A）；ALP 活性檢測(cè)結(jié)果顯示， 糖尿病組ALP 活性較正常組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4B）。

2.5 2 組細(xì)胞基質(zhì)礦化能力比較

2 組細(xì)胞分別成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d 后茜素紅染色觀察， 正常對(duì)照組成骨誘導(dǎo)后可見大量礦化結(jié)節(jié)，而糖尿病組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后僅見少量小面積的礦化結(jié)節(jié)（圖5A）。 茜素紅半定量分析結(jié)果顯示，糖尿病組細(xì)胞體外礦化結(jié)節(jié)的形成能力較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5B）。

2.6 成骨相關(guān)基因檢測(cè)

2 組細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d 后熒光定量PCR 結(jié)果顯示， 與正常對(duì)照組比較， 糖尿病組細(xì)胞Runx2和OCNmRNA 的表達(dá)量顯著下降， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖6）。

圖3 2 組細(xì)胞增殖能力比較Figure 3 Comparison of the proliferation activity

圖4 2 組細(xì)胞ALP 活性Figure 4 Comparison of the ALP activity

2.7 NF-κB p65 核蛋白表達(dá)

NF-κB p65 蛋白活化入核是NF-κB 信號(hào)通路激活的標(biāo)志， 因此本實(shí)驗(yàn)比較了2 組細(xì)胞NF-κB p65 核蛋白的表達(dá)。 Western blot 結(jié)果顯示與正常組比較，糖尿病組細(xì)胞NF-κB p65 核蛋白表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖7）。

圖2 2 組大鼠上頜骨牙槽骨吸收和骨形態(tài)分析Figure 2 Micro-CT images showing maxillary alveolar bone resorption and the morphometric evaluations of rats

圖5 2 組細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)染色及半定量分析Figure 5 Comparison of the alizarin red staining and semiquantitative assay

圖6 2組細(xì)胞成骨基因表達(dá)Figure 6 Comparison of osteogenic gene expression

3 討論

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類健康的全身代謝性疾病，可引起繼發(fā)性骨量減少和骨質(zhì)疏松等糖尿病性骨病。 糖尿病患者骨量減少和骨質(zhì)疏松發(fā)病率為40%～70%， 并且骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)非糖尿病人群，增加了約2 倍[4-5]，同時(shí)糖尿病患者發(fā)生進(jìn)行性牙槽骨吸收和頜骨骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)亦顯著提高[6-7]。 研究認(rèn)為糖尿病可影響長骨結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致骨密度降低，骨小梁稀疏、數(shù)目減少，從而加大骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。 但是糖尿病對(duì)頜骨微結(jié)構(gòu)的影響，目前報(bào)道較少[8]。 本研究建立實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型，利用micro-CT 研究糖尿病對(duì)牙槽骨吸收和頜骨結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，糖尿病可加速模型大鼠牙槽骨吸收， 使頜骨骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）降低，骨小梁數(shù)目（Tb.N）減少，骨小梁間隙(Tb.Sp)增加，從而導(dǎo)致頜骨的骨質(zhì)疏松。

圖7 2 組細(xì)胞NF-κB p65 核蛋白表達(dá)Figure 7 Comparison of the nuclear protein expression of NF-κB p65

BMSCs 是一種具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，其成骨分化功能降低是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的重要機(jī)制。 與正常來源的BMSCs 相比，糖尿病來源的BMSCs 成骨分化能力顯著減弱[9]；高糖培養(yǎng)下BMSCs 脂肪生成標(biāo)記物表達(dá)和衰老表型增加，成骨分化標(biāo)記物表達(dá)降低[10]。 高糖微環(huán)境通過糖原合成酶激酶-3 抑制大鼠BMSCs 的增殖、 遷移和成骨分化[11]。頜骨來源的BMSCs 是口腔中具有代表性的間充質(zhì)干細(xì)胞之一，具有與長骨來源BMSCs 相類似的生物學(xué)特性，能夠向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮樣細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等分化[3]；頜骨BMSCs 具有來源豐富、取材方便、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)等特點(diǎn)，被認(rèn)為是口腔再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重要的種子細(xì)胞。 有研究發(fā)現(xiàn)，體外高糖培養(yǎng)條件可降低正常頜骨BMSCs 的成骨分化[12]。 本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)糖尿病大鼠頜骨BMSCs，與正常大鼠BMSCs 相比，細(xì)胞增殖能力降低，ALP 活性和鈣結(jié)節(jié)形成減少， 成骨相關(guān)基因Runx2和OCNmRNA 表達(dá)下降。上述結(jié)果表明糖尿病可影響頜骨BMSCs 的成骨分化能力。

研究發(fā)現(xiàn)NF-κΒ 信號(hào)通路與細(xì)胞成骨分化密切相關(guān)。體內(nèi)轉(zhuǎn)染特異性NF-κB 抑制基因可防止由于卵巢切除引起的成年小鼠骨量喪失[13]，體外抑制NF-κB 活性可促進(jìn)BMSCs 分化和礦化[14]；同時(shí)NFκB 通路的激活與炎癥狀態(tài)下牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力減弱有關(guān)[15-16]。 在非激活狀態(tài)下，NF-κB p65：p50 二聚體和IκB 蛋白形成復(fù)合物位于細(xì)胞漿中，當(dāng)外界刺激使NF-κB 信號(hào)通路激活后， IκB 蛋白被磷酸化而降解，釋放NF-κB p65：p50 二聚體，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控NF-κB p65 蛋白進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠來源頜骨BMSCs 的NF-κB p65 核蛋白表達(dá)增加， 因此推測(cè)這可能與糖尿病狀態(tài)下頜骨BMSCs 的成骨分化能力減弱相關(guān)， 但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。