鄭義彩， 肖國(guó)岫， 洪文偉， 吳 情， 徐 斌

（復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院口腔科，上海 200240）

流行性腮腺炎由腮腺炎病毒引起，近年來(lái)，流行性腮腺炎發(fā)病率在中國(guó)丙類傳染病中排在前3 位，是導(dǎo)致兒童群體發(fā)生突發(fā)公共衛(wèi)生事件的主要病種之一[1]。 根據(jù)流行病學(xué)接觸史及臨床特征，該病一般不難與化膿性腮腺炎鑒別，鑒別要點(diǎn)見(jiàn)表1。但在疾病發(fā)生的早期，準(zhǔn)確鑒別急性化膿性腮腺炎和流行性腮腺炎常常存在困難[2]，主要有以下原因：①急性化膿性腮腺炎早期，炎癥未液化，腮腺導(dǎo)管無(wú)溢膿。 ②急性化膿性腮腺炎早期，患者血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞比例不一定升高。 ③急性化膿性腮腺炎患者由于腮腺導(dǎo)管阻塞，血淀粉酶也可升高。 ④部分患者流行病學(xué)接觸史不詳。 雖然流行性腮腺炎為自限性疾病，一般可痊愈，但如合并腦膜腦炎、睪丸炎等并發(fā)癥將嚴(yán)重危害患者的身體健康[3]。 急性化膿性腮腺炎和流行性腮腺炎病原體不同， 治療原則不同。 流行性腮腺炎潛伏期長(zhǎng)、傳播能力強(qiáng)、防控難度大，若誤診為急性化膿性腮腺炎，造成交叉感染，可能導(dǎo)致疫情暴發(fā)；若誤診導(dǎo)致病情延誤，可能引發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥[4]。 急性化膿性腮腺炎在就診初期容易被誤診為流行性腮腺炎，導(dǎo)致未及時(shí)使用合適的抗生素及其他治療措施，病情延誤致感染進(jìn)一步加重，可能引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥或后期反復(fù)發(fā)作。 因此，早期鑒別診斷急性化膿性腮腺炎和流行性腮腺炎至關(guān)重要。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來(lái)的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[5]。 代謝組學(xué)主要研究生物整體對(duì)外源性物質(zhì)所引起的病理、生理反應(yīng)，對(duì)遺傳變異的反應(yīng)及內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化等，它通過(guò)對(duì)生物體液和組織中隨時(shí)間改變的代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)、 鑒定、定量和分類，將這些代謝信息與病理、生理過(guò)程，生化過(guò)程及生命活動(dòng)相關(guān)聯(lián)[6]。 唾液是齦溝液、黏膜滲出液、唾液腺腺泡超滲液的混合體，儲(chǔ)存了大量的人類和口腔微生物的基因信息。 唾液中還含有口腔局部組織和身體其他部位感染的微生物和病毒，唾液作為監(jiān)測(cè)健康和疾病的新興遞質(zhì)，近年來(lái)得到了越來(lái)越多的關(guān)注，在疾病早期診斷中具有明顯的作用[7-8]。

本研究將唾液代謝組學(xué)應(yīng)用于流行性腮腺炎和急性化膿性腮腺炎，分析流行性腮腺炎和急性化膿性腮腺炎患者唾液的內(nèi)源性代謝物差異，篩選潛在的早期診斷代謝標(biāo)志物，為早期精準(zhǔn)鑒別流行性腮腺炎和化膿性腮腺炎尋找新的診斷手段。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2017-06-01—2019-03-30 就診于上海市第五人民醫(yī)院口腔科的18 例流行性腮腺炎患者和18 例急性化膿性腮腺炎患者，根據(jù)患者是否為首次確診分為發(fā)現(xiàn)集（流行性腮腺炎組及急性化膿性腮腺炎組，每組各8 例首診確診樣本）和驗(yàn)證集（流行性腮腺炎組及急性化膿性腮腺炎組， 每組各10 例首診時(shí)無(wú)法確診的樣本）。 對(duì)于首診時(shí)無(wú)法確診者，根據(jù)病情囑其居家觀察， 分別于臥床休息1、3、7 d后來(lái)院復(fù)查，若癥狀加重，即刻來(lái)院就診。 在后續(xù)診治中根據(jù)臨床癥狀及復(fù)查的血常規(guī)、 血淀粉酶報(bào)告，依據(jù)流行性腮腺炎及化膿性腮腺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，最終確診。

1.2 診斷與排除標(biāo)準(zhǔn)

流行性腮腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：流行性腮腺炎患者接觸史；單側(cè)或雙側(cè)腮腺?gòu)浡阅[大；皮膚紅腫，觸痛明顯；患側(cè)腮腺導(dǎo)管口唾液清亮；白細(xì)胞無(wú)明顯升高，淋巴細(xì)胞比例升高，血淀粉酶升高。 急性化膿性腮腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)流行性腮腺炎患者接觸史；單側(cè)腮腺?gòu)浬⑿阅[大；皮膚紅腫，觸痛明顯；患側(cè)腮腺導(dǎo)管口可見(jiàn)膿性分泌液；白細(xì)胞升高和（或）中性粒細(xì)胞比例升高，血淀粉酶升高或正常。 排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性腎病、糖尿病、高血壓、肝炎及內(nèi)分泌疾病等急性或慢性病史；吸煙、喝酒及其他不良嗜好；口腔出血，牙周炎病史，干燥綜合征病史；肉眼可見(jiàn)唾液中帶血，唾液中含痰液或食物殘?jiān)?；初診不能確診，后期仍無(wú)法確診并自愈者。 本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，參與研究者均知情同意并簽署知情同意書。

表1 流行性腮腺炎與急性化膿性腮腺炎鑒別要點(diǎn)Table 1 Key points for distinguishing between mumps and acute suppurative parotitis

1.3 標(biāo)本采集

發(fā)病48 h 內(nèi)未使用任何藥物或其他治療手段，首次就診時(shí)收集患者唾液標(biāo)本， 收集唾液前1 h 內(nèi)禁食、禁飲、禁煙。受試者清水漱口，等待1 min 后采用自然留取法，囑其頭稍向前傾，向標(biāo)本盒內(nèi)流入3 mL 唾液，裝入4 ℃預(yù)冷的無(wú)菌EP 管中，即刻置于-80 ℃冰箱中保存。

1.4 方法

1.4.1 材料與試劑 色譜級(jí)甲醇、乙腈(默克公司，德國(guó))；HPLC 級(jí)甲酸(Fluka 公司， 瑞士) ；超純水 由Milli-Q 水凈化系統(tǒng)(密立波公司， 美國(guó))制備得到；2-氯-苯丙氨酸-Aldrich (Sigma 公司，美國(guó))。

1.4.2 樣本的制備 將待分析的樣品置于室溫解凍，渦旋均勻，取50 μL 唾液樣本，加入150 μL 的2-氯-苯丙氨酸甲醇溶液（內(nèi)標(biāo)）用于蛋白沉淀及代謝物的提取。 渦旋5 min 后，13 000 rpm 在4 °C 下離心15 min。 取100 μL 上清液置于進(jìn)樣小瓶中待液相色譜-質(zhì)譜分析。 同時(shí)每個(gè)樣品取10 μL 上清液于EP 管中，渦旋混勻，取200 μL 于進(jìn)樣瓶中作為質(zhì)控（quality control，QC）樣本。

1.4.3 代謝組學(xué)分析 使用1290 InfinityⅡ超高效液相系統(tǒng)和安捷倫6545 高分辨單四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 公司，美國(guó))對(duì)唾液樣本和QC 樣本進(jìn)行分析。 色譜分離使用超高壓液相色譜柱（2.5 mm×100 mm×2.5 μm， 沃特世公司，美國(guó))，柱溫40 °C。 流動(dòng)相包括0.1%的甲酸溶液，乙腈。 流速：0.35 mL/min。 色譜梯度為0～2 min，5%乙腈；2～13 min，5%～95%乙腈；13～15 min，95%乙腈。運(yùn)行時(shí)間設(shè)為5 min，用于平衡系統(tǒng)。 質(zhì)譜使用正、負(fù)離子模式分別采集，具體參數(shù)為：毛細(xì)管電壓， 3.5 kV；干燥器流速，10 L/min；氣體溫度，325 °C；霧化器壓力，20 psi；fragmentor 電壓，120 V ；skimmer 電壓，45 V。 質(zhì)譜的采集范圍50～1 100 m/z。 序列中，每6 個(gè)樣本插入1 個(gè)QC 樣本，用于系統(tǒng)穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)。

采集的原始數(shù)據(jù)使用安捷倫Masshanter 定性分析軟件（B.07.00）轉(zhuǎn)換為mzData 格式。 使用開(kāi)源R 軟件包XCMS 對(duì)峰進(jìn)行提取、對(duì)齊和積分。 做內(nèi)標(biāo)歸一化后，導(dǎo)入SIMCA-P 11.0 軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。 將差異離子的精確質(zhì)荷比數(shù)值與在線數(shù)據(jù)庫(kù)Metlin(http://metlin.scripps.edu/)對(duì)比，并進(jìn)行鑒別。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)2 組間差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般情況比較

比較2 組患者的年齡、性別，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。 詳見(jiàn)表2。

2.2 發(fā)現(xiàn)集代謝組學(xué)輪廓分析及差異代謝物篩選

正、負(fù)離子模式下，唾液樣本的典型總離子流色譜圖（total ion chromatogram， TIC）見(jiàn)圖1。 使用XCMS 軟件進(jìn)行峰的提取后， 正離子模式下共有1 734 個(gè)離子，負(fù)離子模式下有885 個(gè)離子。

將所有唾液樣本和QC 樣本進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA），以觀測(cè)離群值及監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。PCA 是一種非監(jiān)督性的模型分析方法，可以可靠地反映各組之間最真實(shí)的差異。 所有唾液樣本及QC 樣本的PCA 得分如圖2 所示，在正負(fù)模式下QC 的聚集程度良好，表明系統(tǒng)的穩(wěn)定性良好。

使用有監(jiān)督的偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA） 來(lái)篩選流行性腮腺炎組和急性化膿性腮腺炎組發(fā)現(xiàn)樣本的差異物質(zhì)。 2 組的PLS-DA 得分圖如圖3 所示，其中 正 離 子 模 式 下R2X=0.587， R2Y=0.994， Q2=0.815；負(fù)模式下R2X=0.587， R2Y=0.995， Q2=0.898。正、負(fù)離子模式下模型均良好。

表2 兩組患者臨床資料Table 2 Clinical data of patients

圖1 唾液樣本正、負(fù)離子模式下典型的總離子流色譜圖Figure 1 Typical total ion chromatogram of saliva sample in positive and negative ion mode

圖2 所有唾液樣本和QC 樣本的PCA 得分圖Figure 2 PCA score chart of all saliva samples and QC samples

PLS-DA 的計(jì)算變量投影重要度（variable importance for the projection， VIP）值＞1，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)P＜0.05 的離子認(rèn)為是2 組間差異的離子，共鑒別出32 個(gè)差異代謝物，如表3 所示。

2.3 診斷標(biāo)志物的驗(yàn)證及效能評(píng)價(jià)

圖3 流行性腮腺炎組和急性化膿性腮腺炎組發(fā)現(xiàn)樣本的PLS-DA得分圖Figure 3 PLS-DA scores of samples found in the mumps group and acute suppurative parotitis group

在2 組驗(yàn)證樣本（各10 例）中提取32 個(gè)差異代謝物的量值， 計(jì)算急性化膿性腮腺炎組與流行性腮腺炎組的差異倍數(shù) （fold change，F(xiàn)C） 值及P值， 其中在驗(yàn)證樣本中也有顯著差異且變化趨勢(shì)一致的2 個(gè)代謝物分別是十一酸（undecanoic acid）和磷脂酰膽堿(phosphatidyl cholines， PC)(P-18:1/18:1)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證此代謝物組合的潛在診斷效能，我們將2 個(gè)代謝物使用二元logistic 回歸聯(lián)合構(gòu)建預(yù)測(cè)模型 （圖4）。 發(fā)現(xiàn)樣本接受者操作特征曲線(receiver operating characteristic curve， ROC) 最大曲線下面積（area under the cure，AUC）為1，驗(yàn)證樣本中得到的ROC 最大AUC 為0.926。 結(jié)果表明，我們篩選的十一酸和磷脂酰膽堿(P-18:1/18:1)可以作為唾液樣本潛在的標(biāo)志物組合。

表3 流行性腮腺炎組和急性化膿性腮腺炎組發(fā)現(xiàn)樣本中的差異代謝物列表Table 3 List of differential metabolites found in the mumps group and acute suppurative parotitis group

3 討論

圖4 兩個(gè)代謝物在發(fā)現(xiàn)樣本和驗(yàn)證樣本中構(gòu)建預(yù)測(cè)模型的ROC曲線Figure 4 ROC curve of the combination of two metabolites in the discovery and verification samples to build a prediction model

基于高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間高分辨譜聯(lián)用技術(shù)（UHPLC-QTOF/MS）的唾液代謝組學(xué)方法，本研究篩選出急性化膿性腮腺炎與流行性腮腺炎的32 個(gè)差異代謝物，并在20 個(gè)驗(yàn)證樣本中進(jìn)一步驗(yàn)證了這些差異代謝物的診斷效能，最終篩選出十一酸和磷脂酰膽堿(P-18:1/18:1)2 個(gè)代謝物作為唾液樣本潛在的標(biāo)志物組合。

流行性腮腺炎一直受到廣泛關(guān)注，在其被納入擴(kuò)大免疫規(guī)劃后的幾年內(nèi)， 發(fā)病率并未見(jiàn)明顯下降；而且隨著流行性腮腺炎的病程延長(zhǎng)，其并發(fā)癥的發(fā)生率也逐漸增加[9]，因此腮腺炎的早期診斷尤為重要。 臨床主要根據(jù)流行病學(xué)接觸史、臨床特征及實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行診斷。 對(duì)于難以明確診斷的病例， 多項(xiàng)研究通過(guò)尋找不同的方法進(jìn)行輔助診斷。腮腺炎的高頻B 超聲像圖表現(xiàn)為腺體增厚，實(shí)質(zhì)性的腺體回聲增粗、增強(qiáng)，分布不均勻；受侵腺體血流信號(hào)明顯豐富，血流速度增加，重者呈“蜂窩狀”改變。 B 超雖然能準(zhǔn)確顯示出受侵腺體的個(gè)數(shù)和相鄰組織的變化， 且能動(dòng)態(tài)觀察患者病情變化， 但在疾病早期，僅從聲像圖的表現(xiàn)難以鑒別化膿性腮腺炎和流行性腮腺炎[10]。2007-02，加拿大新斯科舍省的1 所大學(xué)暴發(fā)了流行性腮腺炎。 Hatchette 等[11]利用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction， PCR）等分子方法通過(guò)尋找2 082 名患者的3 410 份口腔或尿液樣本的病毒病原體來(lái)確診腮腺炎。 盡管檢測(cè)流行性腮腺炎病毒的方法非常有效， 但在疫情高峰期，只有14.3% (298/2 082)的病例被確診。 本研究利用唾液代謝組學(xué)方法篩選出十一酸和磷脂酰膽堿(P-18:1/18:1)2 個(gè)代謝物， 發(fā)現(xiàn)樣本ROC 最大AUC為1， 驗(yàn)證樣本中得到的ROC 最大AUC 為0.926。結(jié)果表明，這一標(biāo)志物組合可以作為急性化膿性腮腺炎與流行性腮腺炎潛在的早期預(yù)測(cè)標(biāo)志物組合。

唾液作為巨大的生物標(biāo)志物儲(chǔ)存庫(kù)，具有重要的研究?jī)r(jià)值。 唾液可以以非侵入性的、相對(duì)無(wú)壓力的方式被收集， 而且沒(méi)有很高的病毒感染風(fēng)險(xiǎn)，在過(guò)去10 年間， 其作為診斷工具的研究越來(lái)越多。“唾液組學(xué)” 一詞被用來(lái)描述從人類唾液研究中獲得的信息，包括基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)，其中基于質(zhì)譜法的檢測(cè)方法是最有效的[12]。目前，唾液檢測(cè)被用于早期診斷阿爾茨海默病[12]、糖尿病[13]、牙周炎[8]、口腔癌[14]等。本研究首次將唾液代謝組學(xué)應(yīng)用于腮腺炎的鑒別診斷，可能為早期鑒別流行性腮腺炎和急性化膿性腮腺炎提供1 種新的診斷手段。

大量流行病學(xué)研究顯示兒童和青少年是流行性腮腺炎的主要感染人群。 在人群分布上，86.39%的流行性腮腺炎病例集中在年齡＜15 歲的人群中，5～9 歲年齡組發(fā)病率最高[15]。但由于本研究在口腔科門診收集病例時(shí)， 研究對(duì)象主要為成年人，故本研究中流行性腮腺炎組的平均年齡為28～31 歲，此為本研究的局限性。

綜上所述，本研究利用唾液代謝組學(xué)的方法篩選出十一酸和磷脂酰膽堿(P-18:1/18:1)這一代謝物組合，作為早期鑒別診斷流行性腮腺炎和急性化膿性腮腺炎的潛在標(biāo)志物，后續(xù)仍需在大規(guī)模的腮腺炎人群中進(jìn)一步驗(yàn)證這一代謝物組合的診斷效果。