許志文，吳 楚，蒲 堯，葉緣銘

(長(zhǎng)江大學(xué) 園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

植物內(nèi)生真菌(endophytic fungus)是指在其生活史的一部分階段或全部階段生活于健康植物的各種組織、器官內(nèi)部的真菌，被其感染的宿主植物不表現(xiàn)或者暫時(shí)不表現(xiàn)出明顯的病害癥狀[1]。內(nèi)生真菌普遍存在于各種陸生和水生植物中，不但種類繁多，而且分布范圍較廣[2]，主要分布于植物的葉鞘、種子、花、莖、葉片和根等細(xì)胞間。研究發(fā)現(xiàn)，宿主植物在感染內(nèi)生真菌時(shí)比沒(méi)有感染內(nèi)生真菌更具生存競(jìng)爭(zhēng)力，如生長(zhǎng)速度快，抗逆境、抗病害和抵抗動(dòng)物危害的能力加強(qiáng)等，而這些能力的增強(qiáng)，依賴于內(nèi)生真菌寄生或者定殖在宿主植物體內(nèi)的階段所產(chǎn)生出來(lái)的一些次生代謝產(chǎn)物。研究表明，從植物中分離出的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，且產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物十分豐富，具有多種生物活性[3]。近年來(lái)，由于內(nèi)生真菌的次生代謝物在病蟲(chóng)害的生物防治[4]和醫(yī)藥工業(yè)[5]上的用途和范圍逐漸增大，有關(guān)內(nèi)生真菌的研究逐漸受到重視。

菌根輔助細(xì)菌(mycorrhiza helper bacteria, MHB)是指能夠與菌根真菌特異性結(jié)合，并促進(jìn)菌根真菌在宿主植物根部的定殖、生長(zhǎng)，從而間接地促進(jìn)植物生長(zhǎng)的一類植物根際細(xì)菌[6]。菌根輔助細(xì)菌與菌根真菌雙接種可顯著促進(jìn)菌根真菌孢子萌發(fā)、促進(jìn)真菌菌絲生長(zhǎng)，提高菌根侵染率等，從而有效地促進(jìn)寄主植物生長(zhǎng)[7]。因此，菌根真菌與菌根輔助細(xì)菌作為植物微環(huán)境中的重要組成部分，在提高植物產(chǎn)量、維持農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定等方面都具有重要作用[8]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是世界性分布的內(nèi)生真菌，常在土壤中、腐爛的木材上被發(fā)現(xiàn)[9]，其不但具有適應(yīng)廣、代謝物質(zhì)多樣、寄生廣泛、環(huán)境友好等特點(diǎn)[10]，且能與植物的根系共生并有效地促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)和發(fā)育，使其從土壤中獲取更多營(yíng)養(yǎng)，通過(guò)增加不溶性化合物的溶解性和微量營(yíng)養(yǎng)素的可利用性[11]，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及產(chǎn)量的提高。木霉菌與植物共生能提高植物葉片中葉綠素的含量，并且可以有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和干物質(zhì)的積累[12]。陸淼等[13]研究表明，使用哈茨木霉(Trichodermaharzianum)對(duì)甜瓜進(jìn)行接種，能有效地促進(jìn)甜瓜幼苗生長(zhǎng)。李進(jìn)一等[14]研究發(fā)現(xiàn)，短密木霉(Trichodermabrevicompactum)能顯著促進(jìn)黃瓜幼苗側(cè)根的生長(zhǎng)發(fā)育。袁揚(yáng)等[15]研究表明，木霉菌能促進(jìn)鴨茅葉片中的葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白含量增加。伍曉麗等[16]研究表明，深綠木霉(Trichodermaatroviride)發(fā)酵液菌絲體能顯著促進(jìn)青蒿幼苗生長(zhǎng)。楊興堂等[17]研究表明，木霉菌株(Trichodermaasperellum)能降解磷鉀，同時(shí)可以產(chǎn)生吲哚乙酸，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。另有研究發(fā)現(xiàn)，木霉菌產(chǎn)生的生長(zhǎng)素和赤霉素是促進(jìn)植物生長(zhǎng)和刺激養(yǎng)分從土壤向根系轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵激素[18]，如施用棘孢木霉(Trichodermaasperellum)能提升香蕉苗株高和根系活力。

洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacepacia)是一種廣泛存在于土壤、水和植物根圍的革蘭氏陰性細(xì)菌，其不僅是一個(gè)種，而是指一組表型相近、基因型不同的細(xì)菌群，通稱為洋蔥伯克氏菌群(Burkholderiacepaciacomplex, Bcc)[19]。洋蔥伯克細(xì)菌具有多種有益功效，其不僅可作為生物降解菌降解土壤中殘留的農(nóng)藥、凈化污水，還可以作為植物促生菌促進(jìn)植物生長(zhǎng)[19-20]。

世界上已知柑橘的栽培歷史已超過(guò)4 000年[21]，其產(chǎn)量和年貿(mào)易額次于小麥和玉米，為世界第三大國(guó)際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品和世界第一大水果[22]。而枳殼(Poncirustrifoliata)作為柑橘的常用砧木，其生長(zhǎng)狀況的優(yōu)劣對(duì)于柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起著部分的決定作用。而棘孢木霉作為植物的內(nèi)生真菌，在植物體內(nèi)產(chǎn)生許多活性代謝物，從而對(duì)植物起到促進(jìn)生長(zhǎng)的作用[23]。有研究表明，洋蔥伯克霍爾德細(xì)菌也能對(duì)植物起到一定的促進(jìn)生長(zhǎng)的作用[19]。目前，鮮見(jiàn)木霉菌和洋蔥伯克霍爾德細(xì)菌處理枳殼的報(bào)道。為此，研究枳殼在木霉菌和洋蔥伯克霍爾德細(xì)菌不同處理下，其光合作用的變化和生物量的積累差異以及根系的發(fā)育情況，以期為柑橘砧木枳殼的快速生長(zhǎng)及柑橘的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

枳殼種子：采自長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院園藝實(shí)習(xí)場(chǎng)。棘孢木霉(Trichodermaasperellum，Ta，BNCC227595)和洋蔥伯克霍爾德細(xì)菌(Burkholderiacepacia，Bc，BNCC138591)，均購(gòu)自北納生物科技有限公司(http://www.bnbio.com/)。

試劑：PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、KMnO4溶液。

儀器：血球計(jì)數(shù)板、光學(xué)顯微鏡、恒溫?fù)u床、LI-6400 XT便攜式光合作用系統(tǒng)(Li-COR, USA)、FS-3000便攜脈沖調(diào)制式熒光儀、WINRHIZO根系掃描儀器、恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電子天平。

1.2 方法

1.2.1 菌株孢子菌懸液的制備 棘孢木霉活化后，在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，先用無(wú)菌水洗脫孢子后，再用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，配制成濃度為1×108spores/mL的孢子菌懸液，于4℃冰箱保存待用。

將保存于-80℃的洋蔥伯克霍爾德細(xì)菌在PDA固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后，挑取單菌落于250 mL的LB液體培養(yǎng)基中28℃ 200 r/min搖瓶過(guò)夜培養(yǎng)，待其搖到渾濁后取出，于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將枳殼種子置于0.1%的KMnO4中浸泡2 h，無(wú)菌水漂洗3次，播種在滅菌河沙內(nèi)進(jìn)行育苗，待出苗后，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的枳殼幼苗移栽到花盆(直徑15 cm，高10 cm)中，盆中盛裝園藝育苗培養(yǎng)基質(zhì)(經(jīng)高壓蒸汽滅菌法滅菌)，每個(gè)花盆1 kg/盆。

移苗后對(duì)枳殼進(jìn)行分組處理，共設(shè)4個(gè)處理：處理1，接種棘孢木霉(Ta)，移苗10 d后對(duì)該組每株枳殼進(jìn)行灌根接種，接種量為每株20 mL Ta菌絲菌懸液(10 g/L)+20 mL無(wú)菌水；處理2，接種洋蔥伯克霍爾德細(xì)菌(Bc)，移苗10 d后對(duì)該組每株枳殼進(jìn)行灌根接種，接種量為每株20 mL Bc細(xì)菌懸液+20 mL無(wú)菌水；處理3，接種棘孢木霉+洋蔥伯克霍爾德細(xì)菌(Ta+Bc)，移苗10 d后對(duì)該組每株枳殼進(jìn)行灌根接種，接種量為每株20 mL Bc細(xì)菌懸液+20 mL Ta菌絲懸液；處理4，對(duì)照(CK)，移苗10 d后對(duì)該組每株枳殼進(jìn)行無(wú)菌水澆灌，澆水量為40 mL。處理后的全部枳殼幼苗均置于自然采光的人工大棚中培育，每隔2 d對(duì)其進(jìn)行澆灌無(wú)菌水，定期對(duì)其進(jìn)行維護(hù)管理。120 d后對(duì)其進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定。

1.3 考察指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 氣體交換及葉綠素?zé)晒獾臏y(cè)定 選擇晴天10:00～12:00進(jìn)行測(cè)定，采用LI-6400 XT便攜式光合作用系統(tǒng)(Li-COR, USA)測(cè)定枳殼葉片的氣體交換指標(biāo)。各處理取樣3株，每株取第3～4葉序處的功能葉，重復(fù)3次。測(cè)定時(shí)光照強(qiáng)度設(shè)為500 μmol/(m2·s)，測(cè)定指標(biāo)包括植物的凈光合速率[Pn，μmol/(m2·s)]、蒸騰速率[Tr，mmol/(m2·s)]、氣孔導(dǎo)度[Gs，mol/)m2·s)]和胞間CO2濃度(Ci，μmol CO2/mol)等。

采用FS-3000便攜脈沖調(diào)制式熒光儀對(duì)枳殼葉片的葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)進(jìn)行測(cè)定，各處理取樣3株，每株取第3～4葉序處的功能葉，重復(fù)3次，記錄枳殼葉片的電子傳遞效率(ETR)以及暗適應(yīng)30 min之后的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)。

用凈光合速率除以蒸騰速率得水分利用效率(water utilization efficiency，WUE，100%)；用凈光合速率除以當(dāng)時(shí)測(cè)定時(shí)設(shè)定的光強(qiáng)[500 μmol/(m2·s)]得光能利用效率(light use efficiency，LUE，100%)；用凈光合速率除以細(xì)胞間二氧化碳濃度得瞬時(shí)羧化效率[carboxylation efficiency，μmol/(m2·s)]。計(jì)算按照GABRIELA等[24]的方法進(jìn)行。

1.3.2 根系形態(tài)指標(biāo)的測(cè)定 將生長(zhǎng)120 d后的枳殼植株全部收獲，將枳殼植株的根部用清水沖洗干凈后，對(duì)所有的枳殼植株的根系采用WINRHIZO根系掃描儀器進(jìn)行掃描，記錄其總長(zhǎng)度、總表面積、平均直徑和總體積的數(shù)據(jù)，具體細(xì)節(jié)參照朱艷霞等[25]的方法進(jìn)行。

1.3.3 生物量的測(cè)定 將收獲后的枳殼植株裝入紙袋中，放入100℃烘箱內(nèi)殺青10 min，然后在80℃下烘至恒重。取出紙袋和材料，冷卻至室溫，用分析天平稱取枳殼的總干重以及各部位干重(地上部分干重、地下部分干重、葉干重和莖干重)，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以便后期進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 22.0和EXCEL 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，以P=0.05為顯著性檢驗(yàn)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)枳殼植株葉片氣體交換的影響

2.1.1 枳殼幼苗氣體交換 從圖1可知，不同處理對(duì)枳殼葉片凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、細(xì)胞間CO2和蒸騰速率的影響。枳殼葉片凈光合速率，Ta與Ta+Bc顯著高于Bc和CK。Bc與CK間、Ta與Ta+Bc間均無(wú)顯著差異。葉片氣孔導(dǎo)度，Ta+Bc顯著小于其他3個(gè)處理，CK、Ta和Bc間差異不顯著。枳殼葉片細(xì)胞間CO2濃度，接種Bc處理最大，為281.755 6 μmol CO2/mol，顯著高于其余處理。CK與Ta間無(wú)顯著差異，均顯著高于Ta+Bc。

枳殼葉片蒸騰速率，Bc最高，顯著高于Ta和Ta+Bc，與CK間無(wú)顯著差異；CK其次，隨后依次是Ta和Ta+Bc，三者間均無(wú)顯著差異。

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:Different lowercase letters indicate significance of difference atP<0.05 level.The same kelow.

圖1 不同處理枳殼幼苗的氣體交換變化

Fig.1 Gas exchange changes ofP.trifoliataseedlings under different treatments

2.1.2 枳殼幼苗水分、光能利用效率及羧化效率 從圖2可知，不同處理對(duì)枳殼幼苗水分、光能利用效率及羧化效率的影響。枳殼幼苗水分利用效率，Ta+Bc最高，為6.69%，依次為Ta+Bc>Ta>CK>Ta，且差異顯著。

光能利用效率，Ta+Bc顯著高于CK和Bc，稍高于Ta，Ta+Bc與Ta間、Ta與Bc和CK間差異不顯著。

羧化效率，Ta+Bc顯著高于Ta和CK，同時(shí)，Ta和CK間差異不顯著；Bc最低，為0.56μmol/m2·s，但與CK差異不顯著。

Fig.2 Water utilization efficency, light utilization efficiency and carboxylation efficiency ofP.trifoliataseedlings under different treatment

2.1.3 枳殼幼苗葉綠素?zé)晒庵笜?biāo) 從圖3可看出不同處理對(duì)枳殼幼苗電子傳遞速率及最大光合速率的影響。電子傳遞速率，Bc最高，為34.17；依次為Bc>Ta>Ta+Bc>CK，且差異顯著。最大光化學(xué)效率，Ta+Bc最高，為0.63；依次為Ta+Bc>Bc>Ta>CK，且差異顯著。

2.2 不同處理對(duì)枳殼植株根系發(fā)育的影響

從圖4可看出不同處理對(duì)枳殼植株總根長(zhǎng)、根總表面積、根平均直徑和根體積的變化。幼苗總根長(zhǎng)，Ta、Bc和Ta+Bc均顯著高于對(duì)照，但各接種處理間差異不顯著。根總表面積，Bc顯著高于其余處理，其余處理間差異不顯著。根平均直徑，依次為CK>Bc>Bc>Ta+Bc，且差異顯著。根體積，Bc略大于Ta，且二者顯著大于Ta+Bc；Bc與Ta、Ta與CK間差異不顯著，CK顯著高于Ta+Bc。

Fig.4 Total root length, total root surface area, average root diameter and total root volume ofP.trifoliataseedlings under different treatment

2.3 不同處理對(duì)枳殼植株生物量的影響

從圖5可看出不同處理枳殼總干重、地下部總干重、地上部分干重、莖干重和葉片干重的變化。枳殼總干重，Bc與Ta+Bc均顯著高于CK和Ta，Ta與CK間、Bc與Ta+Bc間無(wú)顯著差異。枳殼地下部分干重，Bc顯著高于其余處理，Ta顯著高于CK和Ta+Bc，CK和Ta+Bc間無(wú)顯著差異。枳殼地上部分干重，Ta+Bc和Bc顯著高于CK和Ta，Ta+Bc與Bc間、Ta與CK間差異不顯著。枳殼莖干干重，Ta+Bc顯著高其余處理，Bc顯著高于Ta和CK，且Ta與CK間無(wú)顯著差異。 枳殼葉片干重，Ta+Bc與Bc間無(wú)顯著差異，但二者顯著高于CK和Ta，而CK與Ta間無(wú)顯著差異。

Fig.5 Total dry weight, root dry weight, shoot dry weight, stem dry weight and leaf dry weight ofP.trifoliataunder different treatment

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，棘孢木霉單獨(dú)接種時(shí)，其凈光合速率高于對(duì)照，表明棘孢木霉作為植物的內(nèi)生真菌，其接種可促進(jìn)植物的凈光合速率，此結(jié)果與林燕青等[26]的一致。接種棘孢木霉+洋蔥伯克霍爾德菌比接種棘孢木霉更能提高其凈光合速率，與WU等[27]的研究結(jié)果基本一致。接種棘孢木霉+洋蔥伯克霍爾德菌的枳殼葉片電子傳遞效率與最大光化學(xué)效率均顯著高于對(duì)照，與WU等[27]的研究結(jié)果基本一致。此外，接種棘孢木霉+洋蔥伯克霍爾德菌時(shí)，枳殼的水分、光能利用效率和羧化效率均最高，與范克勝等[28]羧化效率在楊樹(shù)上的研究結(jié)果一致。

有研究表明，棘孢木霉能夠促進(jìn)黃瓜根系的生長(zhǎng)[29]，并且當(dāng)菌根真菌與細(xì)菌對(duì)植物共同接種時(shí)更加能夠促進(jìn)植物的根系發(fā)育[27]，與研究相同，接種棘孢木霉和接種棘孢木霉+洋蔥伯克霍爾德菌時(shí)，枳殼的總根長(zhǎng)顯著高于對(duì)照。接種棘孢木霉和接種棘孢木霉+洋蔥伯克霍爾德菌均能促進(jìn)枳殼的生物量累積，且接種棘孢木霉+洋蔥伯克霍爾德菌時(shí)，無(wú)論在總生物量，還是地上或者地下生物量都顯著高于對(duì)照。這與JAYANTHI等[30]的研究結(jié)果一致。接種棘孢木霉和接種棘孢木霉+洋蔥伯克霍爾德菌都促進(jìn)了枳殼的生長(zhǎng)，與宋小雙等[31-33]的研究結(jié)果一致。

植物根際是十分復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，菌根真菌—益生菌—宿主植物三者在相互作用中始終保持著極其微妙的微生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡[33]。菌根輔助細(xì)菌可以促進(jìn)菌根真菌生長(zhǎng)、在宿主植物根部定殖形成菌根共生結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，是外生菌根菌際重要微生物類群[34]。研究發(fā)現(xiàn)，雖然內(nèi)生菌根真菌會(huì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[35]，但是許多土壤細(xì)菌、根際土壤細(xì)菌和菌根根際細(xì)菌也能影響外生菌根的共生[36-40]從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)。1995年CAROLINE等[41]發(fā)現(xiàn)，菌根真菌和植物促生根圈細(xì)菌的共同作用會(huì)比菌根真菌單獨(dú)接種更能提高植物的高度。研究對(duì)枳殼的部分指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，初步探明了洋蔥伯克霍爾德細(xì)菌作為棘孢木霉的菌根輔助細(xì)菌提高了枳殼的光合作用、水分利用效率和光能利用效率，從而促進(jìn)了枳殼的根系發(fā)育，間接地增加了枳殼生物量的累積，最終對(duì)枳殼產(chǎn)生促生作用。但是關(guān)于其促生作用下更深層次的分子間的相互作用的方式方法還有待進(jìn)一步研究。