黃 宇，汪漢成，陳乾麗，向立剛，郭珍妮，李 忠，謝紅煉，韓 潔

(1．貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550081； 3.長江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 4.長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；5.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550312)

煙草白粉病(Tobacco powdery mildew)是煙草生產(chǎn)過程中常見的真菌性氣傳病害[1]，其病原菌為二孢白粉菌(GolovinomycescichoracearumDC)[2-3]。該病主要危害成熟葉片，從下至上發(fā)展，發(fā)病初期病斑呈近圓形的白色霉斑，隨后逐步擴展至整個葉片，嚴重時葉片正反面均覆蓋白色粉狀霉層，最后導(dǎo)致葉組織變黃、枯死[2]。感病煙葉烘烤后缺乏彈性和香味，病害嚴重時煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)損失高達80%[4-5]。目前已有諸多關(guān)于白粉菌侵染植物后導(dǎo)致植物微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化的報道。白維曉等[6]研究發(fā)現(xiàn)，感染白粉病后高抗薔薇的真菌多樣性降低，高感薔薇的真菌多樣性增加。羅路云等[7]研究表明，南瓜葉片感染白粉病后，隨著病情等級的提高，Alpha多樣性指數(shù)呈先降后升趨勢。SUDA等[8]研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜葉片感染白粉病后細菌數(shù)量、多樣性和豐富度均增加。但關(guān)于煙葉感染白粉病后葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性變化的研究卻鮮有報道。

微生物多樣性傳統(tǒng)的分析方法是分離培養(yǎng)法，但自然環(huán)境中可培養(yǎng)微生物只占全部微生物的1%左右，因而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)對揭示微生物的多樣性存在明顯的局限性[9]。高通量測序技術(shù)能夠深入探索環(huán)境微生物的多樣性及其功能，目前已被廣泛應(yīng)用于土壤[10-11]、水體[12]、腸道[13-14]及空氣[15-16]等微生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性研究。為此，以感染白粉病煙株的發(fā)病煙葉和健康煙葉為研究對象，采用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)研究葉際真菌的種群結(jié)構(gòu)和多樣性，旨在為煙草白粉病的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙葉樣品 2016年7月采于貴州省煙草科學(xué)研究院福泉基地。隨機選取3株K326煙草白粉病典型煙株，剪刀經(jīng)酒精消毒后分別剪取各煙株病級為7級的發(fā)病葉片和為病級0級的健康葉片樣品[17]，發(fā)病煙葉(BFB)樣品編號分別為BFAB、BFBB和BFCB，健康煙葉(BFJ)樣品編號分別為BFAJ、BFBJ和BFCJ。樣品采集后置入低溫保藏箱，并迅速帶回實驗室，于-80℃冰箱中保存。

1.1.2 試劑及測序系統(tǒng) FastDNA?Spin kit for Soil總DNA提取試劑盒，MP Biochemicals, Solon, OH, USA；Gene JET膠回收試劑盒，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA；Miseq PE300測序系統(tǒng)，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 NanoDrop 2000超微量分光光度計，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA；peqSTAR PCR儀，PEQLAB Ltd., UK。

1.2 方法

1.2.1 樣品DNA提取、擴增及測序 將煙葉樣品分別稱取0.5 g研磨后，采用總DNA提取試劑盒抽提煙葉樣品微生物基因組總DNA[18]，具體步驟按操作說明進行。提取完成后，使用NanoDrop 2000檢測抽提DNA的濃度和純度，純度A260/A280要求在1.8～2.0[18]。

1.2.2 ITS文庫構(gòu)建及高通量測序 參照文獻[19]的方法以樣品DNA為模板，采用引物ITS1F (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)擴增目標片段的ITS區(qū)。PCR擴增體系和PCR反應(yīng)程序參數(shù)參照VORHOLT等[19]的方法進行設(shè)置。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina公司Miseq PE300平臺進行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參考[18-20]的方法，使用UPARSE(V7.1)根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類，利用RDP classifier對每條序列進行物種注釋，使用Unite(Release 6.0)真菌數(shù)據(jù)庫進行分類注釋。白粉病煙株上發(fā)病煙葉與健康煙葉的真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性評估包括：采用Mothur V1.30.1計算Alpha多樣性指數(shù)，以反映微生物群落的豐富度與多樣性；用Sobs指數(shù)和Chao1指數(shù)反映樣本真菌群落豐富度，指數(shù)值越大群落豐富度越高；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映樣本真菌群落多樣性，Shannon指數(shù)越大或Simpson指數(shù)越小則群落多樣性越高；Coverage指數(shù)表示測序的覆蓋度，其值越高樣品中序列被測出的概率越高，測序結(jié)果的真實性越高[19]。群落Bar圖可以直接反映各樣本在門、屬水平上含有真菌種類和樣本中各真菌的相對豐度；Venn圖用于統(tǒng)計多組樣本中共有和獨有的OTU數(shù)目，揭示健康煙葉與發(fā)病煙葉樣本中OTU的數(shù)目組成相似性及重疊情況。常用稀釋曲線(Rarefaction curve)檢查測序結(jié)果是否合理。以上分析均在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司I-Sanger生信云網(wǎng)站平臺(http://www.i-sanger.com/project/index.html)完成。

4)C=1-(n1/N1)

式中，Sobs為實際觀測到的OTU數(shù)，n1為只含有1條序列的OTU數(shù)目，n2為只含有2條序列的OTU數(shù)目，ni為第i個OTU所含的序列數(shù)，N為所有的序列數(shù)，C為Coverage(覆蓋度)，N1為抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS序列的測序深度與數(shù)據(jù)質(zhì)控

從封2圖Ⅰ看出，6個樣本的稀釋曲線隨樣本讀取數(shù)增加均呈升高趨勢，其中，BFAJ、BFBJ和BFCJ的曲線急劇上升趨勢，BFAB、BFBB和BFCB在樣本讀取數(shù)≤5 000時呈急劇上升趨勢，之后逐漸趨于平緩。表明，測序已趨于飽和，測序深度已經(jīng)足夠，測序數(shù)據(jù)量足以反映樣品中絕大多數(shù)的真菌多樣性信息。原始序列經(jīng)優(yōu)化處理后，白粉病煙株的6個樣本共得到225 011條高質(zhì)量序列片段，64 057 651個堿基，單一樣本序列數(shù)在31 110～43 785條，序列平均長度為280 bp。發(fā)病煙葉3個樣本共測得高質(zhì)量序列片段114 714條，堿基32 443 971個，單一樣本序列數(shù)在31 129～43 785條，序列平均長度為230 bp。健康煙葉3個樣本共得到110 297條高質(zhì)量序列片段，31 613 680個堿基，單一樣本序列數(shù)在31 110～40 167條，序列平均長度為206 bp。

2.2 OTU聚類

從表1看出，在97%的相似度水平對樣品序列進行OTU聚類，白粉病煙株發(fā)病煙葉樣本共鑒定出4個門10個綱13個目16個科20個屬27個種29個OTU的真菌；白粉病煙株健康煙葉樣本共鑒定到6個門23個綱41個目57個科86個屬104個種136個OTU的真菌。從封2圖Ⅱ看出，在屬水平上，白粉病煙株健康煙葉的真菌種類遠高于發(fā)病煙葉。發(fā)病煙葉獨有假尾孢菌屬(Pseudocercospora)、毛孢子菌屬(Trichosporon)、Meyerozyma和異莖點霉屬(Paraphoma)等共計4個真菌屬；健康煙葉獨有節(jié)擔菌屬(Wallemia)、單端孢屬(Trichothecium)、Zymoseptoria、外囊菌屬(Taphrina)和Umbilicaria等共計70個真菌屬；二者共有的真菌屬主要有枝孢屬(Cladosporium)、青霉菌屬(Penicillium)、鏈格孢屬(Alternaria)、念珠菌屬(Candida)和鐮刀菌屬(Fusarium)等共計16個屬。

表1 不同分類水平感染白粉病煙株健康與發(fā)病煙葉真菌群落的數(shù)量

Table 1 Community quantity of fungi in diseased and healthy leaves of tobacco plants infected with powdery mildew at different taxonomic levels 個

樣本Sample門Phylum綱Class目Order科Family屬Genus種Species操作分類單元OTUBFAB381113131415BFBB367781212BFCB3789101516Total4101316202729BFAJ5183243596686BFBJ4162633455156BFCJ4131926384657Total623415786104136

2.3 真菌群落的多樣性指數(shù)

從表2看出，各樣本的覆蓋度指數(shù)均大于0.99，表明，樣本序列被檢出的概率較高，測序結(jié)果能夠表示樣本中實際的真菌群落結(jié)構(gòu)。健康煙葉樣本中真菌群落的Sobs指數(shù)、Chao1和Ace指數(shù)平均分別為66、102和119，均高于發(fā)病煙葉(14、21和28)。表明，白粉病煙株的健康煙葉真菌群落豐富度高于發(fā)病煙葉。健康煙葉樣本中真菌群落的多樣性指數(shù)Shannon和Simpson指數(shù)平均分別為0.321和0.850，發(fā)病煙葉為0.051和0.985。表明，白粉病煙株健康煙葉的多樣性高于發(fā)病煙葉。

表2 不同組別真菌群落的Alpha多樣性指數(shù)(OTU level)

2.4 真菌群落的基本組成

從封2圖Ⅲ看出，在門水平上，發(fā)病煙葉(BFB)真菌群落的優(yōu)勢門為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，分別占檢出真菌總數(shù)的99.90%和0.09%；健康煙葉(BFJ)真菌群落的優(yōu)勢門為子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，分別占檢出真菌總數(shù)的92.96%和0.11%。在屬水平上，發(fā)病煙葉(BFB)真菌群落的主要菌屬為高氏白粉菌屬(Golovinomyces)、曲霉屬(Aspergillus)和鏈格孢屬(Alternaria)，相對豐富度分別為99.22%、0.33%和0.33%；健康煙葉(BFJ)真菌群落的主要菌屬為高氏白粉菌屬(Golovinomyces)、曲霉屬(Aspergillus)和鏈格孢屬(Alternaria)，相對豐富度分別為91.86%、0.34%和0.31%。從表3看出，發(fā)病煙葉(BFB)和健康煙葉(BFJ)真菌群落的豐富度前10位的優(yōu)勢屬中，支頂孢屬(Acremonium，0.05%)、新凸輪孢菌屬(Neocamarosporium，0.05%)和Umbilicaria屬(0.03%)為健康煙葉獨有屬，鐮刀菌屬(Fusarium，<0.01)和赤霉菌屬(Gibberella，<0.01)為發(fā)病煙葉獨有屬，其余真菌所占比例不到總真菌數(shù)量0.1%的菌屬，在各樣品間的含量不存在差異。

表3 發(fā)病煙葉和健康煙葉樣品真菌群落中前10位優(yōu)勢屬的相對豐度

Table 3 Relative abundance of the top 10 dominant genera in fungal community of diseased and healthy tobacco leaves samples %

優(yōu)勢屬 Dominant genus發(fā)病煙葉Diseased tobacco leaves健康煙葉Healthy tobacco leaves高氏白粉菌屬 Golovinomyces99.2291.86曲霉屬 Aspergillus0.330.34鏈格孢屬 Alternaria0.330.31Rhodotorula0.090.06Unclassified-k-Fungi0.01-赤霉菌屬 Gibberella<0.010.02Cladosporium<0.010.04鐮刀菌屬 Fusarium<0.01 -Unclassified-c-Dothideomycetes<0.01 -支頂孢屬 Acremonium-0.05新凸輪孢菌屬 Neocamarosporium-0.05 Umbilicaria-0.03其他 others0.010.16

3 結(jié)論與討論

葉片是微生物棲息的重要場所，這些微生物在幫助寄主對抗病原體方面起著至關(guān)重要的作用[18]。近年來，葉片微生物逐漸受到關(guān)注，并在抗病原物研究中被廣泛應(yīng)用[19-20]。研究采用高通量技術(shù)對白粉病煙株的發(fā)病煙葉和健康煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性進行檢測的結(jié)果表明，白粉病煙株健康煙葉的真菌群落多樣性高于發(fā)病煙葉，其原因可能是白粉菌在發(fā)病煙葉中占較大優(yōu)勢，以致其他微生物種類減少。

經(jīng)Alpha多樣性分析，白粉病煙株的健康煙葉樣品多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均高于發(fā)病煙葉樣品，與前人的研究結(jié)果一致。ZHANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃楊白粉病發(fā)病葉片的真菌多樣性低于健康葉片；SHANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)，百合枯萎病樣品的真菌多樣性低于健康樣品；TAN等[23]研究表明，連作三七感病樣品根際土壤和根系的菌群多樣性低于健康樣品；肖婉鈺[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃龍病砂糖桔感病樣品的菌群多樣性低于健康樣品。

研究結(jié)果表明，白粉病煙株發(fā)病煙葉與健康煙葉的真菌物種組成基本相似。門水平上，發(fā)病煙葉樣品和健康煙葉樣品的優(yōu)勢菌門均為子囊菌門，與其他感染白粉病植物報道一致。ZHANG等[21]發(fā)現(xiàn)，黃楊白粉病葉片真菌群落的優(yōu)勢菌門為子囊菌門；ZHANG等[18]報道，南瓜白粉病的優(yōu)勢菌門為子囊菌門。所有樣本的真菌屬類數(shù)較少，其中，高氏白粉菌屬占優(yōu)勢。邢荷荷等[2，25]研究表明，高氏白粉菌屬能引起煙草白粉??；曾曉葳[26]報道，早期植物病害的特點是絕大多數(shù)葉片甚至全部葉片均處于潛育階段，當煙株感染白粉病后，發(fā)病煙葉和健康煙葉均攜帶白粉病菌，健康煙葉上高氏白粉菌屬的相對豐度高達91.86%，但健康煙葉未表現(xiàn)出典型癥狀，后期可能表現(xiàn)典型癥狀。ZHANG等[21]發(fā)現(xiàn)，黃楊白粉病健康葉片的優(yōu)勢菌屬為白粉菌屬，其相對豐度高達48.68%。在健康煙葉與發(fā)病煙葉中存在相對豐度較高的鏈格孢屬和曲霉屬。裴洲洋[27]研究發(fā)現(xiàn)，鏈格孢屬和曲霉屬為煙草的內(nèi)生真菌，其中鏈格孢屬為優(yōu)勢菌屬。方治國等[28]研究表明，空氣微生物中也含有鏈格孢屬和曲霉屬。

利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對白粉病煙株的發(fā)病煙葉和健康煙葉樣品進行測序分析發(fā)現(xiàn)，白粉病煙株健康煙葉的真菌種類和真菌群落多樣性高于7級病級煙葉，雖然白粉病煙株健康煙葉未表現(xiàn)出典型癥狀，但其仍含有大量煙草白粉病的病原菌屬(高氏白粉菌屬)。結(jié)果將有助于人們了解煙株感染白粉病后，發(fā)病煙葉和健康煙葉的真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，有利于煙草白粉病的科學(xué)防治?？紤]到白粉病為真菌性氣傳病害，對其他煙葉真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響較大，所以僅分析了感病煙株的真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，并未對其細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性進行分析，后續(xù)將開展相關(guān)研究。