王 偉，李柏林①，汪 月，王 恒，李 曄，夭開芳，黃 馨

(1.武漢理工大學資源與環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430070；2.礦物資源加工與環(huán)境湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430070)

氮是誘發(fā)水體富營養(yǎng)化的重要因子，為彌補傳統(tǒng)生物脫氮工藝的不足，新型脫氮技術(shù)引起廣泛關注[1]。其中短程硝化-厭氧氨氧化工藝因?qū)Φ吞嫉?、高濃度氨氮廢水具有良好的處理效果，且能節(jié)省碳源與能源而成為研究熱點[2]。目前高溫下(>30 ℃)維持短程硝化的穩(wěn)定運行已得到中外學者的一致認可，而低溫條件下短程硝化能否維持穩(wěn)定尚存在爭議[3]。傅金祥等[4]研究發(fā)現(xiàn)在溫度為20 ℃，pH值在7.5以上時，NO2--N積累率(NAR)基本維持在51%以上，繼續(xù)下降后短程硝化遭到破壞。榮宏偉等[5]研究了低溫對短程硝化的影響，發(fā)現(xiàn)15 ℃條件下NH4+-N去除率(NRR)為65.4%，NAR為62.1%。郭安等[6]研究得出，當溫度由18 ℃逐漸降至10 ℃并長期維持在較低溫度下可以培養(yǎng)出具有良好物化特性的短程硝化污泥。然而實際城市污水水溫較低(10～25 ℃)，且NH4+-N濃度也處于較低水平，如何實現(xiàn)中低溫低氨氮條件下短程硝化系統(tǒng)的穩(wěn)定運行是目前亟待解決的問題。同時短程硝化-厭氧氨氧化工藝的實現(xiàn)依賴于對前半段短程硝化出水的控制，使其能滿足后半段厭氧氨氧化的進水要求(NO2--N/NH4+-N比值在1.32左右)，即可維持半短程硝化狀態(tài)。為了促進半亞硝化短程反應的順利進行，對系統(tǒng)中硝化細菌的分析和研究也極其重要[7]。出水水質(zhì)與廢水中的優(yōu)勢菌群息息相關，所以研究工藝運行過程中微生物的變化尤為重要。作為新型微生物種群鑒定技術(shù)，高通量測序技術(shù)具有分析結(jié)果準確、高速、高靈敏度和高自動化等特點，在環(huán)境微生物鑒定領域應用廣泛，也越來越多地被應用于短程硝化工藝的微生物群落結(jié)構(gòu)分析中[8]?；诖耍P者先在高溫下快速啟動短程硝化，隨后調(diào)控出水NO2--N/NH4+-N比值為1.32左右，實現(xiàn)半短程硝化，然后運用階梯式降溫方式觀察半短程硝化在中低溫下的運行狀態(tài)，并探究降溫過程中功能菌群落結(jié)構(gòu)的變化，以期為中低溫下半短程硝化調(diào)控策略及其功能菌群落結(jié)構(gòu)分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗裝置

實驗裝置采用有機玻璃制成的圓柱形SBR反應器。如圖1所示，裝置高40 cm，直徑15 cm，有效體積6 L，周期排水比為0.5，曝氣方式為鼓風曝氣，并通過循環(huán)水浴對水浴層進行溫度控制，為反應器內(nèi)部活性污泥提供穩(wěn)定的溫度環(huán)境。

1.2 接種污泥及實驗用水

實驗接種污泥取自武漢市湯遜湖污水處理廠，污泥ρ(MLSS)為5.3 g·L-1。實驗進水為人工配置的無機低氨氮廢水，用水水質(zhì)如下：ρ(NH4Cl)為(230±5) mg·L-1，ρ(NH4+-N)為(60±5) mg·L-1，ρ(KH2PO4)為25 mg·L-1，ρ(NaHCO3)為1 000 mg·L-1，微量元素Ⅰ、Ⅱ分別為1 mL·L-1[9]。

圖1 短程硝化SBR反應器

1.3 實驗方案

實驗主要分為3個階段：短程硝化啟動、半短程硝化調(diào)控及降溫階段(28 ℃→25 ℃→20 ℃→15 ℃)。先通過調(diào)控DO濃度、pH值、游離氨(FA)濃度等運行參數(shù)來實現(xiàn)短程硝化快速啟動。啟動階段為充分激發(fā)氨氧化菌(AOB)活性，促進NO2--N的積累，控制ρ(DO)為1.2～1.5 mg·L-1，進水pH值為7.6～7.7。調(diào)控階段降低ρ(DO)為0.8～1.0 mg·L-1，使出水NO2--N/NH4+-N比值穩(wěn)定在1.32左右。然后通過設置4個降溫梯度，實現(xiàn)中低溫下系統(tǒng)的穩(wěn)定運行。運行周期設定如下：進水5 min，曝氣90～120 min，沉淀15 min，排水5 min，靜置5 min。不同階段的具體運行條件見表1。

1.4 分析及測試方法

1.4.1常規(guī)指標檢測方法

水質(zhì)指標的測定均采用國家標準方法[10]，NH4+-N、NO2--N、NO3--N濃度分別采用納氏試劑分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和麝香草酚分光光度法測定；DO濃度、pH值和溫度通過Hach便攜儀表測定，MLSS采用重量法測定。FA濃度按式(1)[11]計算：

(1)

式(1)中，ρFA為FA質(zhì)量濃度，mg·L-1；ρNH4+-N為NH4+-N質(zhì)量濃度，mg·L-1；T為溫度，℃。

1.4.2高通量測序

取反應器污泥，采用Power Soil試劑盒提取DNA，以w=1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。然后擴增細菌V3～V4區(qū)域16S rDNA基因的引物融合hiSEQ測序平臺的通用引物，采用515F/909對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠(w=2%)電泳檢測，回收DNA，定量檢測PCR產(chǎn)物，之后按樣品的測序量比例混合，進行16S rDNA測序[12]。hiSEQ測序、序列拼接及OUT分類由上海生工股份有限公司完成。

表1 反應器運行工況

Table 1 Operational conditions of the reactor

運行期階段t/d溫度/℃ρ(DO)/(mg·L-1)pH值ρ(MLSS)/(g·L-1)啟動期Ⅰ0～1630±21.2～1.57.9～8.05.3調(diào)控期Ⅱ17～4030±20.8～1.07.6～7.74.7降溫期Ⅲ41～4928±11.4～1.57.6～7.74.1Ⅳ50～7825±11.4～1.57.8～7.93.7Ⅴ79～10120±11.4～1.57.8～7.93.6Ⅵ102～12015±11.4～1.57.8～7.93.4

Ⅰ表示啟動期，Ⅱ表示調(diào)控期，Ⅲ表示降溫期溫度為28 ℃階段，Ⅳ表示降溫期溫度為25 ℃階段，Ⅴ表示降溫期溫度為20 ℃階段，Ⅵ表示降溫期溫度為15 ℃階段。

2 結(jié)果與分析

2.1 半短程硝化脫氮效能分析

2.1.1啟動、調(diào)控階段

短程硝化啟動階段(0～16 d)的水力停留時間(HRT)設置為3 h。啟動初期DO維持在較高的水平,有利于激發(fā)AOB的活性，因此0～8 d反應器內(nèi)ρ(DO)控制為1.5 mg·L-1左右。如圖2所示，此階段出水ρ(NH4+-N)維持在(14±5) mg·L-1，NRR為77.4%左右，但NAR低于18%，且出水ρ(NO3--N)在38.4 mg·L-1左右，說明此階段大部分NH4+-N直接轉(zhuǎn)化為NO3--N，為全程硝化。

圖2 啟動、調(diào)控階段氮的變化

研究表明當ρ(FA)為0.1～1.0 mg·L-1時，亞硝酸鹽氧化菌(NOB)活性受到抑制，而AOB的抑制質(zhì)量濃度為10～150 mg·L-1[13]，第9天開始控制ρ(DO)為1.2 mg·L-1，NRR有所下降，平均NRR為75.2%，通過控制一定的NRR來提高出水的FA以抑制NOB，使出水ρ(FA)保持在0.8～1.13 mg·L-1，對NOB有一定的抑制，有利于AOB活性的提高。第16天出水ρ(NO2--N)為25.3 mg·L-1，而出水ρ(NO3--N)為23.9 mg·L-1，NAR達到52.8%，據(jù)此推斷系統(tǒng)中的NOB開始逐步被淘汰，AOB成為優(yōu)勢菌，成功啟動短程硝化。

經(jīng)過16 d的運行，MLSS由接種時的5.3 g·L-1降為啟動末期的4.7 g·L-1，但反應器內(nèi)的亞硝化反應速率逐漸升高。為了保障反應器出NO2--N/NH4+-N比值滿足后續(xù)厭氧氨氧化進水要求，第17天開始將曝氣時間縮短為90 min，并將ρ(DO)降低至0.8～1.0 mg·L-1。AOB最適ρ(DO)為0.2～1.5 mg·L-1，而NOB的最適質(zhì)量濃度為1.2～1.5 mg·L-1，AOB對氧的親和能力大于NOB，因此在DO濃度較低情況下AOB更易富集[14]。由圖2可知，出水ρ(NO3--N)在第Ⅱ階段沒有明顯波動，維持在1.3 mg·L-1以下，而由于反應時間的縮短，出水ρ(NO2--N)略有下降，從30.8降至24.8 mg·L-1。使得出水NO2--N/NH4+-N比值逐漸得以優(yōu)化，比值由第1天的0.22升至第20天的2.23，第24天之后穩(wěn)定在1.32左右，實現(xiàn)半短程硝化。第Ⅱ階段NAR一直維持在90.8%左右，說明系統(tǒng)內(nèi)AOB豐度增加，NOB得到充分抑制，為后續(xù)階梯式降溫運行奠定了良好的基礎。

2.1.2階梯式降溫階段

半短程硝化調(diào)控優(yōu)化后，在第41～120天對系統(tǒng)進行階梯式降溫。每個階段梯度降溫用循環(huán)水箱逐漸降溫的方式，每隔1 d降低溫度1 ℃，直至降到相應溫度。為提升降溫過程中AOB活性，將ρ(DO)提升到1.4～1.5 mg·L-1，進水pH值提升至7.8～7.9。由圖3所示，在系統(tǒng)內(nèi)溫度逐漸降低的過程中，ρ(NO3--N)均維持在較低的水平(均值為4.5 mg·L-1)，說明NOB豐度可能降至較低水平，DO的提升未造成NO3--N的積累。每次降溫初期NAR、NRR都出現(xiàn)小幅波動，降溫期系統(tǒng)內(nèi)出水ρ(NO2--N)一直保持在22.8 mg·L-1左右(最高值為28.9 mg·L-1，最低值為17.2 mg·L-1)。降溫階段ρ(MLSS)由降溫初期的4.0 g·L-1降至15 ℃時的3.4 g·L-1，推測是由于進水中缺乏有機碳源，且進水負荷較低，異養(yǎng)菌及NOB裂解衰亡所致。在降溫過程中ρ(MLSS)下降緩慢，最終穩(wěn)定在3.4 g·L-1左右，表明此時系統(tǒng)短程硝化能力逐步增加，能夠抵抗低溫帶來的不利影響。

AOB在中低溫下保持良好的活性。即使在15 ℃時，NAR均值為80.2%，呈遞增狀態(tài)。NRR維持在59.7%左右，半短程硝化運行穩(wěn)定。中低溫半短程硝化的穩(wěn)定運行主要依賴于以下2點控制策略：一是在高溫下實現(xiàn)AOB的富集，并通過調(diào)節(jié)運行參數(shù)(DO濃度、pH值、FA濃度、曝氣時間等)促進AOB的富集，同時盡可能抑制NOB的生長，使AOB成為系統(tǒng)中的優(yōu)勢菌種，高溫下形成穩(wěn)定的半短程硝化運行狀態(tài)。二是采用階梯式降溫方式馴化AOB，使其逐漸適應低溫環(huán)境，避免AOB因溫度劇烈變化而失活。由于溫度的下降，AOB活性會有所降低，但系統(tǒng)內(nèi)隨著時間的推移豐度也逐漸增加。同時將ρ(DO)提升到1.4～1.5 mg·L-1，進水pH值提升至7.8～7.9，通過以上調(diào)控策略和方法成功實現(xiàn)了中低溫下半短程硝化的穩(wěn)定運行。

圖3 階梯式降溫階段系統(tǒng)內(nèi)氮的變化

2.2 高通量測序結(jié)果分析

2.2.1微生物豐富度和α多樣性

對接種污泥(A)、降溫初始階段溫度為28 ℃(B)和降溫后期溫度為15 ℃(C)時的污泥樣品進行高通量測序，3個污泥樣品的覆蓋率(coverage)指數(shù)均高于95%以上(表2)，表明測序數(shù)據(jù)量合理且大量的微生物可被檢出，測序結(jié)果能夠全面有效地反映微生物群落結(jié)構(gòu)特征。

表2 微生物群落豐富度和α多樣性

Table 2 Microbial community richness and α diversity

污泥種類覆蓋率Ace指數(shù)Chao指數(shù)香農(nóng)(Shannon)指數(shù)辛普森(Simpson)指數(shù)A0.952 16734 812.7817 894.345.815 6340.009 652B0.952 64824 948.6411 530.774.586 7780.049 034C0.961 18515 417.339 039.645.296 6380.023 073

A、B和C分別指接種污泥、接種污泥降溫初始階段溫度為28 ℃和接種污泥降溫后期溫度為15 ℃時的污泥樣品。

Ace指數(shù)和Chao指數(shù)用來估計群落中操作分類單元(OTU)數(shù)目的指數(shù)，反映微生物種群的豐富度，值越高表明微生物種群豐富度越高[15]。由表2可知，A、B、C樣品群落豐富度逐漸降低，這可能是低溫下微生物生長緩慢，導致微生物數(shù)量減少。香農(nóng)(Shannon)指數(shù)和辛普森(Simpson)指數(shù)常用來評價微生物樣品的生物多樣性，香農(nóng)指數(shù)越大，辛普森指數(shù)越小，說明樣品生物多樣性越高[16]。如表2所示，接種污泥取自污水廠好氧池，生物多樣性較高，隨著對污泥的馴化和定向培養(yǎng)，生物多樣性有所降低。而C樣品中群落多樣性高于B，說明階梯式降溫后，為適應溫度變化，生物多樣性有所增加。

2.2.2主要功能菌群落結(jié)構(gòu)分析

A、B、C樣品中分別檢測出微生物24門44綱272屬、24門38綱187屬和29門45綱213屬。反應器內(nèi)各階段微生物種類豐富但微生物的相對豐度不同。在門水平上，短程硝化系統(tǒng)內(nèi)變形菌門(Proteobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)是菌群結(jié)構(gòu)的主要組成部分，約占總體的60%～80%(圖4)。IBARBALZ等[17]研究表明，在城市污水處理廠污泥中最豐富的是變形菌門，該菌門在A、B、C污泥樣品中分別占33.82%、25.38%和37.26%。大多數(shù)與脫氮有關的菌都屬于Proteobacteria菌門，包括AOB中亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)、亞硝化球菌(Nitrosococcus)和 NOB 中硝化桿菌屬(Nitrobacter)、亞硝化球菌屬(Nitrococcus)均屬于變形菌門[18]。隨著系統(tǒng)短程硝化反應不斷馴化，裝甲菌門呈逐漸減少的趨勢，分別占35.14%、16.22%和6.40%，此外，在半短程硝化運行過程中，裝甲菌門、綠彎菌門等明顯減少。而酸桿菌門(Acidobacteria)豐度增加，說明該菌門能很好地適應低溫環(huán)境。

A—接種污泥樣品，B—接種污泥降溫初始階段溫度為28 ℃的污泥 樣品，C—接種污泥降溫后期溫度為15 ℃時的污泥樣品。

在綱水平上，A、B、C樣品中豐度較大的有浮霉菌綱(Planctomycetia)、α-變形菌綱(α-phaproteobacteria)、β-變形菌綱(β-proteobacteria)。NOB主要屬于α-變形菌綱、δ-變形菌綱(δ-proteobacteria)、硝化螺旋菌綱(Nitrospira)。A樣品中α-變形菌綱豐度達到20.92%，B樣品中α-變形菌綱降至9.83%，但在C中略有上升。而樣品硝化螺旋菌綱一直處于降低狀態(tài)?？傮w而言，NOB得到了有效的抑制。AOB主要屬于β變形菌綱。由圖5可知，與A樣品相比，B中β-變形菌綱達10.24%，并在C樣品中持續(xù)上升到13.47%，AOB不斷得到富集，這也解釋了為什么NAR均值在中低溫下仍能穩(wěn)定在83.3%左右。浮霉菌綱屬于浮霉菌門，其豐度隨著系統(tǒng)運行逐漸下降，由接種污泥的34.87%下降至C樣品中的5.53%，與浮霉菌門下降幅度一致。

在屬水平上，AOB相關菌屬亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)呈逐漸上升態(tài)勢，從A樣品中的0.09%上升至B樣品的1.94%，C樣品中達5.21%，說明在中低溫條件下亞硝化單胞菌可以穩(wěn)定生長。NOB相關菌屬亞硝化螺旋菌(Nitrospira)和硝化桿菌(Nitrobacter)豐度明顯減小，分別從A樣品的0.90%和0.98%逐漸下降到C樣品中的0.33%和0.05%。NOB在系統(tǒng)運行過程得到充分抑制，使運行過程中出水NO3--N濃度處于較低狀態(tài)，保證了中低溫下系統(tǒng)的穩(wěn)定運行。Candidatuskuenenia是厭氧氨氧化(AAOB)菌屬，在B樣品中突升至10.82%(圖6)，此階段DO濃度較低，為AAOB的生長提供了條件。該菌種可能消耗了部分NH4+-N和NO2--N，導致28 ℃下NAR比30 ℃下有所降低，而NRR有所提升。通過提升ρ(DO)為1.4～1.5 mg·L-1，C樣品中Candidatuskuenenia下降到0.60%。

A—接種污泥樣品，B—接種污泥降溫初始階段溫度為28 ℃的污泥 樣品，C—接種污泥降溫后期溫度為15 ℃時的污泥樣品。

A—接種污泥樣品，B—接種污泥降溫初始階段溫度為28 ℃的污泥 樣品，C—接種污泥降溫后期溫度為15 ℃時的污泥樣品。

3 結(jié)論

(1)進水ρ(NH4+-N)為(60±5) mg·L-1，控制系統(tǒng)ρ(DO)為1.2～1.5 mg·L-1，pH值為7.9～8.0，溫度為(30±2)℃，可抑制NOB活性，第16天NAR達到52.8%，成功啟動短程硝化。

(2)通過階梯式降溫(28 ℃→25 ℃→20 ℃→15 ℃)逐步馴化AOB，并將ρ(DO)提升到1.4～1.5 mg·L-1，進水pH值提升至7.8～7.9，強化中低溫條件下AOB的硝化性能。即使在15 ℃條件下，反應器NRR均值維持在59.7%左右，NAR達80.2%，系統(tǒng)在中低溫下運行穩(wěn)定。

(3)采用16S rDNA高通量測序分析培養(yǎng)前后(接種污泥、28 ℃、15 ℃)系統(tǒng)中污泥的菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)隨著系統(tǒng)運行的逐步穩(wěn)定，亞硝化單胞菌呈逐漸上升態(tài)勢，從接種污泥中的0.09%上升至28 ℃下的1.94%，在15 ℃下已達5.21%，成為AOB優(yōu)勢菌屬。而亞硝化螺旋菌和硝化桿菌豐度明顯減小，分別由接種污泥的0.90%和0.98%下降到15 ℃下的0.33%和0.05%，NOB得到充分抑制。