馮 闖，左中夫，劉文強，劉學政△

(1.遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847；2.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121001)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)狀態(tài)下Müller細胞受損會導致細胞外谷氨酸異常增加，從而激活谷氨酸受體，引起視網(wǎng)膜損傷[1]，因此保護受損傷的Müller細胞尤為重要。紅景天苷為植物紅景天的提取物，現(xiàn)代醫(yī)學已經(jīng)確認其具有抗炎、降血糖、調(diào)血脂等作用。近年來還發(fā)現(xiàn)，其具有很強的神經(jīng)保護作用[2], 從而被廣泛應用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療中[3-4]，但其對DR的影響及作用機制目前尚不明確。因此，本研究欲觀察紅景天苷是否對糖尿病早期大鼠Müller細胞的損傷具有神經(jīng)保護作用，為其對DR的臨床應用及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

雄性SD大鼠56只，體質(zhì)量 180～220 g，購自錦州醫(yī)科大學實驗動物中心(SCXK(遼)2014-16)。本實驗通過錦州醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會審查。

1.2 試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，美國Sigma公司；紅景天苷，大連美侖公司；神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、谷氨酸合成酶(glutamate synthase, GS)、甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde dehydrogenase, GAPDH)一抗，英國Abcam公司；谷氨酸含量檢測試劑盒、熒光二抗及Western blot二抗，北京碧云天公司；熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；冰凍切片機，德國SLEE公司；水平電泳儀：美國BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 模型制備及給藥方法

大鼠正常飲食3 d后，隔夜禁食水，配制1.5 g·L-1STZ溶液(50 mg·kg-1)腹腔給藥。給藥3 d后尾靜脈血糖檢測，將大于16.7 mmol·L-1的大鼠作為糖尿病模型。按隨機數(shù)字表法將糖尿病大鼠分為糖尿病組、紅景天苷組及二甲雙胍組(陽性對照)3組各14只，另取14只正常大鼠作為對照組。紅景天苷組給予紅景天苷灌胃治療(200 mg·kg-1)[3]，每日2次，二甲雙胍組給予二甲雙胍(20 mg·kg-1·d-1)[5]。對照組、糖尿病組等劑量PBS緩沖液灌胃，1個月后進行各項指標檢測。

2.2 樣本制備

1個月后每組取4只大鼠，4%多聚甲醛灌注固定取出大鼠眼球于固定液中，用于免疫熒光。每組4只大鼠麻醉后取視網(wǎng)膜于2.5 ml EP管內(nèi)裂解，冰上剪碎，4 ℃離心機25 min后取上清，-20 ℃保存用于Western blot。另外每組取6只大鼠檢測谷氨酸含量。

2.3 視網(wǎng)膜谷氨酸含量檢測

取視網(wǎng)膜于1.5 mL離心管內(nèi)，5000 r/min離心后棄上清，蒸干再加入100 μL H2O及50 μL衍生劑孵育20 min，再加入250 μL樣品稀釋液，取20 μL進樣，詳細步驟嚴格按照說明書進行，按照蛋白濃度計算谷氨酸含量。

2.4 免疫熒光檢測視網(wǎng)膜GFAP、GS表達

眼球經(jīng)30%蔗糖脫水，OCT包埋切片10 μm。載玻片于 PBS洗滌3次；3%山羊血清+0.3% Triton-100室溫孵育1 h；不洗，滴加兔抗大鼠GFAP(1∶300)、兔抗大鼠GS(1∶400)，4 ℃過夜；PBS洗滌4次；滴加二抗，室溫1 h；PBS洗滌4次；封片后熒光顯微鏡觀察。

2.5 Western blot檢測視網(wǎng)膜GFAP、GS相對表達量

BCA法檢測蛋白濃度，確定電泳時加入15 μL樣品；電泳、轉膜后1% BSA室溫封閉2 h；加入一抗(兔抗大鼠GFAP，1∶5000；兔抗大鼠GS，1∶10000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌4次，加入二抗室溫2 h，孵育后TBST洗滌4次，ECL顯影，Image J軟件分析灰度值。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 大鼠血糖變化及糖尿病模型的建立

表1示，造模前各組血糖之間總體差異無統(tǒng)計學意義(P> 0.05)。造模后與對照組比較，后3組血糖均大于16.7 mmol·L-1，說明造模成功；與糖尿病組比較，紅景天苷組血糖有所下降，但仍高于正常(P<0.01)，二甲雙胍組血糖明顯下降至正常(P<0.01)。

表1 各組大鼠血糖變化比較

注：與對照組比較：△△P<0.01；與糖尿病組比較：☆☆P<0.01

3.2 視網(wǎng)膜谷氨酸含量變化

表2示，與對照組比較，糖尿病組谷氨酸含量明顯升高(P<0.01)。與糖尿病組比較，紅景天苷組及二甲雙胍組谷氨酸含量明顯下降，且二甲雙胍組下降更明顯(P<0.01)。

3.3 免疫熒光檢測GFAP、GS表達

圖1表3示，將對照組GFAP、GS熒光強度設定為100.00%，與對照組比較，糖尿病組GFAP熒光強度有所升高，GS熒光強度明顯下降(P<0.01)。與糖尿病組比較，紅景天苷組GFAP、GS熒光強度明顯升高(P<0.01)。

表2 各組大鼠谷氨酸含量比較

注：與對照組比較：△△P<0.01；與糖尿病組比較：☆☆P<0.01

3.4 Western blot 檢測GFAP、GS表達

圖2表3示，與對照組比較，糖尿病組GFAP表達有所升高，GS表達明顯下降(P<0.01)。與糖尿病組比較，紅景天苷組GFAP、GS熒光強度明顯升高(P<0.01)。

4 討論

盡管微血管損傷為DR不可或缺的一部分，但神經(jīng)損傷亦參與DR的發(fā)展進程，且損傷發(fā)生于血管病變之前[6]。DR狀態(tài)下Müller細胞損傷會引起谷氨酸異常增加，從而對視網(wǎng)膜造成毒性作用，因此保護受損傷的Müller細胞尤為重要。

表3 免疫熒光及Western blot檢測各蛋白表達比較

注：與對照組比較：△△P<0.01；與糖尿病組比較：☆☆P<0.01

注：A.對照組；B.糖尿病組；C.紅景天苷組；D.二甲雙胍組

眾多學者對紅景天苷進行了大量實驗[7-8]。實驗已經(jīng)確認，紅景天苷抗炎、降血糖、調(diào)血脂等作用突出。近年來還發(fā)現(xiàn)，其具有很強的神經(jīng)保護作用，對糖尿病等疾病的治療效果明顯，但對DR狀態(tài)下Müller細胞損傷的影響尚不清楚。Shih-Yu Lee等在體外和體內(nèi)實驗均證實，紅景天苷可激活AMPK信號對抗肝臟糖異生途徑進而降低血糖[9]。而鞠霖杰等證實，紅景天苷可保護胰島β細胞，從而實現(xiàn)降低血糖的作用[10]。這與本研究結果相一致。

Müller細胞功能異?？梢餌R神經(jīng)損傷[11]。GFAP為Müller細胞標志物，但視網(wǎng)膜功能正常時幾乎不表達GFAP，當Müller細胞出現(xiàn)病理損傷時視網(wǎng)膜GFAP表達增加[12]。本研究顯示，對照組節(jié)細胞層內(nèi)GFAP微量表達，但DR時其他部位也出現(xiàn)GFAP弱表達，這可能為Müller細胞活化對自身損傷的反應。而紅景天苷治療后視網(wǎng)膜全層均可見GFAP陽性表達，陽性分布趨勢與Müller細胞走向一致。該結果提示，紅景天苷在DR狀態(tài)下可有效上調(diào)視網(wǎng)膜GFAP的表達。

GS表達于Müller細胞內(nèi)，可對分解谷氨酸從而減輕谷氨酸堆積對視網(wǎng)膜的損傷[13]，可見GS對視網(wǎng)膜功能的穩(wěn)定尤為重要[14]。本實驗結果顯示，DR狀態(tài)下GS的表達明顯下降，伴隨谷氨酸含量的增加，說明Müller細胞已經(jīng)受到一定的損傷，清除谷氨酸的功能下降。而應用紅景天苷后，GFAP的表達明顯增加，GS的表達亦有所增加，同時谷氨酸含量得到一定的清除。有學者證實，白藜蘆醇可上調(diào)GS的表達進而能預防視網(wǎng)膜功能障礙[15]。而上調(diào)視網(wǎng)膜谷氨酸轉運體(glutamate transporters, GLAST)的表達，對谷氨酸進行有效的清除，可防止視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的凋亡[16]。因此，本研究推測紅景天苷可能通過上調(diào)GFAP、GS表達及降低谷氨酸含量，對DR狀態(tài)下Müller細胞起到一定的神經(jīng)保護作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷可通過降血糖及上調(diào)視網(wǎng)膜GFAP、GS表達及降低谷氨酸含量，對DR狀態(tài)下Müller細胞起到一定的神經(jīng)保護作用。但因DR發(fā)病機理繁多，紅景天苷對DR的影響可能與多種信號通路有關，紅景天苷對DR的治療作用需多項研究驗證。