潘璐 鄒旭 張往祥 彭冶

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué))，南京，210037) (南京林業(yè)大學(xué))

土地鹽漬化是當(dāng)今世界性的資源問題和生態(tài)問題，越來越嚴(yán)重地威脅到農(nóng)作物與觀賞植物正常的生命活動[1]。我國鹽堿地面積有3 400×104hm2[2]，約占可用耕地面積的25%，廣泛分布于“三北地區(qū)”和沿海地區(qū)[3]。蘋果(MaluspumilaMill.)的耐鹽性中等，它的耐鹽能力主要取決于砧木。因此，選擇耐鹽能力強(qiáng)的砧木是提高蘋果耐鹽性的關(guān)鍵[4]。前人對蘋果砧木已經(jīng)進(jìn)行了一系列耐鹽能力的測定，篩選出了美國黃海棠(AmericamalusSpectabil.)、珠美海棠(Maluszumi(Matsum) Reder.)、小金海棠(MalusxiaojinensisCheng et Jiang.)和八棱海棠(MalusrobusstaRehd.)等具有一定耐鹽性，觀賞價值的品種[5-8]。而山荊子(Malusbaccata(L.) Borkh.)和湖北海棠(Malushupehensis(Pamp.) Rehd.)為我國本土植物，山荊子主要分布于中國的東北、華北及西南地區(qū)，湖北海棠分布于我國黃河流域以南大部分省區(qū)。兩種海棠花果美麗、樹形優(yōu)雅，是蘋果屬重要的種質(zhì)資源，但對山荊子和湖北海棠耐鹽能力及兩者間的耐鹽性比較鮮有報道。

本試驗通過人工模擬鹽脅迫，對鹽脅迫下山荊子和湖北海棠幼苗葉片生長、葉色和生理生化指標(biāo)進(jìn)行了研究。探討并對比山荊子和湖北海棠的耐鹽性與適應(yīng)機(jī)制，以期為生產(chǎn)上蘋果苗木砧木的選擇提供理論依據(jù)，也為豐富鹽堿地區(qū)的園林植物資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材與取樣

供試植株為湖北海棠和山荊子1年生實生苗，由揚州小蘋果有限公司提供。2018年3月中旬將材料定植于口徑20 cm、高28 cm的無紡布盆中，每盆兩棵，盆中基質(zhì)為當(dāng)?shù)靥镩gV(黃土)∶V(林下泥炭土)∶V(珍珠巖)=4∶1∶1。將盆置于30 cm口徑的托盤上，給與正常的水分管理，使植株恢復(fù)穩(wěn)定生長。

供試植株移入溫室大棚后，采用隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，每區(qū)組4個鹽濃度處理，共兩個區(qū)組，每區(qū)組每種鹽各處理40株苗木，共計320株苗木。按照0、0.1%、0.3%、0.5%的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度排列。參考前人的研究方法[9]，有一定改動，經(jīng)計算分別加入鹽的量為0 g，0.1% 161.36 g，0.3% 484.08 g，0.5% 806.8 g。為防止一次性加入鹽溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高植物出現(xiàn)燒苗現(xiàn)象，將各處理組NaCl總質(zhì)量平均分為4份，連續(xù)4 d加入。在加鹽前適度控水，用針管將鹽溶液緩緩注入土壤里，以保證鹽分在土壤中均勻分布。

在脅迫后的第1、7、14、21、28、35天，隨機(jī)選取3株長勢良好的植株，從幼苗頂部往下數(shù)第3或4輪成熟葉片。

1.2 指標(biāo)測定及方法

采用蒽酮比色法測定可溶性糖；丙二醛(MDA)采用硫代巴比綏酸法測定[10]；超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性測定均采用酶聯(lián)免疫吸附法[11]，所用試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供；葉綠素含量的測定采用95%乙醇浸提法[12]。

1.3 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行繪圖；用IBM SPSS Statistics 20.0專業(yè)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan 法顯著性檢驗(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對兩種海棠葉片形態(tài)的影響

由圖1、圖2可知，未經(jīng)NaCl處理的兩種海棠在整個試驗期間葉色無顯著變化，始終保持綠色。經(jīng)NaCl處理的兩種海棠表現(xiàn)出明顯的鹽害癥狀，并隨著鹽濃度的增加和脅迫時間延長鹽害癥狀加劇，表現(xiàn)為葉片失綠、焦枯甚至掉落死亡。

脅迫至21 d時，0.1%鹽脅迫下的山荊子葉片表現(xiàn)正常，而0.3%和0.5%鹽脅迫下葉片出現(xiàn)枯黃。湖北海棠在脅迫至28 d時，0.3%和0.5%的鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的湖北海棠葉片才開始出現(xiàn)枯黃，0.3%鹽脅迫枯黃程度較輕微，而0.5%鹽脅迫下邊緣枯黃嚴(yán)重。脅迫結(jié)束時(35 d)，0.1%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下山荊子可正常生長；0.5%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下山荊子葉片枯黃嚴(yán)重，老葉幾乎凋落殆盡，僅保留少數(shù)幼葉。這嚴(yán)重影響了植株生長。湖北海棠在0.1%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下生長正常，葉片與對照無明顯差異；0.3%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下葉片部分枯黃，而0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下葉片大面積枯黃甚至脫落，影響正常生長。

2.2 鹽脅迫對兩種海棠存活率的影響

植株在鹽脅迫下的存活率是植物能否適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境的直觀體現(xiàn)。由表1可看出，鹽脅迫35 d后，山荊子和湖北海棠在對照和0.1%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下存活率均為100%。表明兩種海棠幼苗在0.1%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下能正常生長。隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，兩種海棠的存活率下降。在0.3%和0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，山荊子和湖北海棠雖然多數(shù)葉片焦枯脫落,但莖干保持了活性，表明兩種海棠具有一定的耐鹽能力。統(tǒng)計結(jié)果表明湖北海棠的存活率大于山荊子，暗示了湖北海棠的耐鹽性可能優(yōu)于山荊子。

表1 鹽脅迫下兩種海棠的存活率

2.3 鹽脅迫對兩種海棠葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖3可知，未進(jìn)行鹽脅迫的對照組葉綠素含量相對穩(wěn)定。在鹽脅迫下，兩種海棠的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著鹽脅迫時間的延長整體呈下降趨勢。山荊子在0.1%鹽脅迫下，1～14 d有一個緩慢上升的階段，隨后開始緩慢下降，至脅迫結(jié)束時含量與脅迫開始較相近但仍低于對照組。而0.3%、0.5%鹽脅迫下，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直在減少，脅迫開始的1～7 d緩慢減少，7～35 d期間下降速率較快，35 d時葉綠素含量相比對照組分別減少了42.6%、51.2%。湖北海棠在0.1%下葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)緩慢減少，至35 d時與對照組差異不顯著。0.3%、0.5%鹽脅迫下，下降得較快，至35 d時葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較對照組相比分別減少了26.9%、39.6%。脅迫至35 d時，各鹽濃度下，湖北海棠葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為山荊子的1.30、1.73、1.69倍，且整個脅迫期間，湖北海棠葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比山荊子高，降幅也較小。

2.4 鹽脅迫下兩種海棠丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度的變化

由圖4可知，未進(jìn)行鹽脅迫(對照)的兩種海棠植株MDA質(zhì)量摩爾濃度相對穩(wěn)定，而處理組的海棠植株MDA質(zhì)量摩爾濃度出現(xiàn)了明顯變化，隨著鹽濃度的升高而增加。山荊子在鹽脅迫第1 d時，各梯度鹽濃度處理與對照組無顯著差異(p>0.05)，隨著鹽脅迫時間的延長MDA質(zhì)量摩爾濃度逐漸增加，各處理在脅迫35d時達(dá)到最大值，分別為對照組的1.28、1.94、2.87倍。湖北海棠在脅迫初期(1～7 d)各處理組與對照組相比差異不顯著，隨著脅迫時間的延長MDA質(zhì)量摩爾濃度逐漸增加，各處理在脅迫第35 d時達(dá)到最大值，分別為對照組的1.42倍、1.86倍、2.52倍。同時，在0.3%、0.5%下，山荊子MDA質(zhì)量摩爾濃度分別為湖北海棠的1.10倍、1.20倍。

2.5 鹽脅迫下兩種海棠可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化

由圖5可知，山荊子和湖北海棠葉片的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)對鹽脅迫的響應(yīng)存在差異。山荊子在0.1%鹽濃度下，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨脅迫時間的延長而升高，在0.3%、0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，隨脅迫時間的延長，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，并于21 d達(dá)到峰值。湖北海棠在0.1%和0.3%鹽處理下，隨著脅迫時間的延長，葉片中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨脅迫時間的延長而升高；在0.5%處理下隨脅迫時間的延長，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在28 d時達(dá)到峰值。在相同鹽處理下，湖北海棠可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值的時間較山荊子晚，達(dá)到峰值時，各鹽處理下，湖北海棠可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)值分別為山荊子的1.18、1.19、1.08倍。

2.6 鹽脅迫下兩種海棠SOD活性的變化

在整個鹽脅迫期間，各個鹽處理下的山荊子和湖北海棠SOD活性總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。在鹽處理1～14 d時，山荊子葉片的SOD活性隨鹽處理的升高而增強(qiáng)，在14～35 d時，隨鹽處理的升高而呈先升高后降低趨勢。在0.1%、0.3%、0.5%鹽處理下SOD活性隨著鹽處理時間的延長，均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，并分別在第28、21、14天達(dá)到峰值，為對照的1.52倍、1.90倍、1.64倍。湖北海棠SOD活性在1～21 d隨鹽處理的增加呈上升趨勢，在第21～35 d時，隨著鹽濃度的增加，呈先上升后下降趨勢。0.1%鹽處理下，SOD活性隨鹽脅迫時間的延長呈逐漸上升趨勢，在第35 d達(dá)到最大值，為對照的1.69倍；在0.3%、0.5%鹽脅迫下，隨著脅迫時間的延長SOD活性呈先上升后下降的趨勢，并分別在脅迫第28、21 d達(dá)到峰值，為對照的2.15倍、1.83倍。在各梯度鹽處理下，湖北海棠的峰值達(dá)到峰值的時間較山荊子均延后了一星期，且峰值分別為山荊子的1.00 、1.07、1.06倍。

2.7 鹽脅迫下兩種海棠POD活性的變化

由圖7可以看出，在整個鹽脅迫過程中山荊子和湖北海棠POD與SOD活性變化趨勢基本一致，總體上呈先上升后下降的趨勢。山荊子在鹽處理第1 d時，各處理組與對照組呈現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)；第1～14 d，POD活性隨著鹽濃度的增加呈上升趨勢，第14～35 d隨鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。0.1%、0.3%、0.5%鹽脅迫下POD活性均隨著鹽脅迫時間的延長呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，并分別在第28、21、14 d達(dá)到最大值，為對照組的1.43倍、1.80倍、2.06倍。湖北海棠在鹽處理的第1～21 d POD活性隨鹽處理的增加呈增上升趨勢，在第21～35 d隨鹽處理的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。0.1%鹽脅迫下，POD活性隨著鹽處理時間的延長逐漸升高，脅迫第35 d時達(dá)到最大值，為對照組的1.41倍；在0.3%、0.5%鹽脅迫下隨著鹽處理時間的延長，均呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，并分別在第28、21 d達(dá)到最大值，為對照的1.66倍、1.79倍。與SOD活性相一致，在各鹽處理下，湖北海棠的峰值達(dá)到峰值的時間較山荊子均延后了一星期，且峰值分別為山荊子的1.11倍、1.23倍、1.16倍。

2.8 鹽脅迫下兩種海棠CAT活性的變化

由圖7可以看出，在整個鹽脅迫過程中山荊子葉片CAT活性總體上呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。在鹽處理第1 d時，處理組與對照組無顯著性差異(p>0.05)。之后，各鹽處理下CAT活性隨著鹽脅迫時間的延長，先升高后降低，并在脅迫第21 d 達(dá)到峰值，分別是對照的1.48倍、1.81倍、1.87倍。而湖北海棠葉片CAT活性，隨著鹽濃度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，除0.5%濃度在35 d時下降外，其余鹽處理下均隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)上升趨勢。脅迫35 d時各處理濃度由低到高分別為對照的1.61倍、2.15倍、2.02倍。兩種海棠在鹽脅迫后期CAT活性顯著上升，同一鹽處理下湖北海棠比山荊子晚達(dá)到峰值，且在0.3%、0.5% 下，湖北海棠CAT活性值分別為山荊子的1.04、1.21倍。

3 結(jié)論與討論

葉片是植物制造有機(jī)養(yǎng)料的器官，通過光合作用為其它器官提供所需能量。因此植株受到脅迫時，葉片直接表現(xiàn)出直觀的受害癥狀[13]。葉色是反應(yīng)植物健康狀況和營養(yǎng)狀況的敏感指標(biāo)[14]。葉片的顏色主要由葉綠素、類胡蘿卜素和花青素等決定[15]。當(dāng)葉片葉綠素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)占的比值較大時(60%以上)，葉片呈現(xiàn)綠色；當(dāng)葉片中花色素苷占的比值較大時(60%～80%)，葉片呈現(xiàn)紅色[16]。鹽脅迫下，植物葉片內(nèi)的葉綠體會遭到破壞，抑制葉綠素的合成或者促進(jìn)葉綠素的降解[17]，從而影響了葉片色素的成分和比例。山荊子和湖北海棠葉片在鹽處理質(zhì)量分?jǐn)?shù)0、0.1%下，植株葉片均成綠色，并未表現(xiàn)出鹽害癥狀。葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著鹽脅迫時間延長和鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈下降趨勢。而整個脅迫過程中，湖北海棠葉綠素較山荊子相比，總量更高且下降速率和量較緩慢。

在0.3%、0.5%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，山荊子在脅迫21 d時開始出現(xiàn)黃化，葉片邊緣卷曲焦枯。同時，在21 d時山荊子葉綠素開始急劇下降，0.5%脅迫下下降速率更快，表明葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的減少對葉色變化有直接影響。湖北海棠葉片則脅迫28 d后才開始出現(xiàn)鹽害癥狀，鹽害程度較山荊子而言較輕，相應(yīng)地，湖北海棠葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也是從28 d后開始出現(xiàn)明顯下降的趨勢。兩種海棠葉片焦枯失綠，可能是因為鹽脅迫會使植株水分虧缺，破壞了細(xì)胞的膜系統(tǒng)，損害了葉綠體功能，進(jìn)一步影響葉綠素合成，也促進(jìn)了葉綠素酶對葉綠素的分解，導(dǎo)致葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，使得細(xì)胞內(nèi)色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比值發(fā)生變化。與孫方行等對海棠(Malusspectabil)、石榴(Punicagranatum)和桃樹(Amygdaluspersic)的研究結(jié)果相一致[18]。

植物在鹽脅迫下的成活率是直接反應(yīng)植物能否適應(yīng)鹽環(huán)境的指標(biāo)之一。本試驗中，在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0、0.1%下山荊子和湖北海棠的存活率均為100%；隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高植株的存活率降低。在0.5%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下山荊子和湖北海棠的成活率分別為72%和81.33%。楊文翔等人的研究表明山荊子抗鹽性耐鹽性差[19]，而本試驗結(jié)束后，0.5%鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下山荊子大部分植株只是葉片脫落而莖干未死亡，存活率仍達(dá)到了72%?？赡苁潜敬卧囼灄l件的限制，脅迫天數(shù)較短的原因，使得山荊子存活率較高。

植物在遭受逆境脅迫過程中，由于自由基的產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡關(guān)系被破壞，致使活性氧積累，引發(fā)并加重膜脂過氧化作用，造成丙二醛(MDA)大量增加，使細(xì)胞膜系統(tǒng)受到破壞[20]。因此MDA變化可以作為衡量植物在鹽脅迫下受傷害程度大小。實驗結(jié)果表明，整個脅迫過程中山荊子和湖北海棠幼苗葉片內(nèi)的MDA質(zhì)量摩爾濃度均隨著鹽濃度的增加而增加。說明脅迫初期可能是植物在短時間內(nèi)能通過自身的防御系統(tǒng)保護(hù)細(xì)胞免受損害。隨著時間的延長，活性氧產(chǎn)生速率的增加，細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷嚴(yán)重，超過自身調(diào)節(jié)能力，膜脂過氧化作用加劇，造成MDA大量積累，積累的MDA與膜蛋白結(jié)合引起蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚合，引起膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞，使質(zhì)膜透性增大，細(xì)胞內(nèi)溶物大量外滲，從而影響海棠葉片的生理代謝功能，使幼苗葉片出現(xiàn)變黃，卷枯，衰老死亡，甚至使整個植株受害加重[21]。而且湖北海棠MDA的增幅均小于山荊子，表明山荊子膜系統(tǒng)受損程度較湖北海棠嚴(yán)重。由此推測，鹽脅迫下活性氧的大量積累是傷害的重要兩種海棠葉片受鹽害的原因之一。

在鹽漬化土壤中，植物同時遭受滲透脅迫。滲透脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)是非鹽生植物對脅迫的一種生理響應(yīng)機(jī)制[27]?？扇苄蕴?、甜菜堿、脯氨酸、可溶性蛋白和多元醇等是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[28]。植物可通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持體內(nèi)滲透水分平衡、穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和滲透勢，從而保護(hù)植物減少或免受脅迫傷害[29]。本試驗結(jié)果顯示，山荊子和湖北海棠隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和脅迫時間的延長，葉片可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，但在相同鹽處理下湖北海棠積累的可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)比山荊子多。表明在鹽脅迫早期兩種海棠能夠通過增加可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)來降低滲透勢，且湖北海棠的調(diào)節(jié)能力稍強(qiáng)于山荊子，山荊子對鹽脅迫更加敏感。隨著鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加和脅迫時間的延長兩種海棠的滲透調(diào)節(jié)能力超過一定的閾值而降低，同時鹽脅迫后期凈光合速率的降低使糖合成量減少，導(dǎo)致可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。本研究與新疆野蘋果(Malussieversii(Ledeb.) Roem.)[30]、桑樹(Morusalba)[31]等研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，湖北海棠耐鹽性要高于山荊子，山荊子對鹽害較敏感，不適宜種植在鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高(p>0.5%)的環(huán)境中。