王 敏 李 穎 王向東 張 羅

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 耳鼻咽喉頭頸科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鼻病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

慢性鼻竇炎(chronic rhinosinusitis，CRS)按照是否合并鼻息肉(nasal polyps，NP)分為慢性鼻竇炎不合并鼻息肉(chronic rhinosinusitis without nasal polyps，CRSsNP)和慢性鼻竇炎合并鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)。CRSsNP主要是以Th1反應(yīng)為主，在歐洲CRSwNP主要以Th2反應(yīng)為主，在亞洲除了Th2反應(yīng)，Th17反應(yīng)也是主要參與通路之一[1-3]。

白細(xì)胞介素-23(interleukin-23,IL-23)屬于IL-12家族成員，為異二聚體，包括IL-23特異性的p19亞單位和與IL-12共享的p40亞單位。IL-23受體相應(yīng)的也為異二聚體，由IL-12Rβ1和IL-23R兩個(gè)亞單位組成。IL-23R主要表達(dá)在T細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T cell，NKT)、單核細(xì)胞和樹突細(xì)胞。IL-23在Th17細(xì)胞的分化中具有重要作用，但是IL-23并不能促使初始T細(xì)胞(naive T cell)體外向Th17細(xì)胞分化，因?yàn)閚aive T cell表面無IL-23R表達(dá)。Naive T cell首先在轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β,TGF-β1)、IL-6和IL-21的作用下形成承諾性Th17細(xì)胞，這種細(xì)胞表面有IL-23R的表達(dá)，隨后在IL-23的作用下分化成Th17細(xì)胞[4]。IL-23-Th17通路參與了多種疾病的發(fā)生，例如牛皮癬[5]、 關(guān)節(jié)炎[6]、炎性腸病[7]等。有研究[8]證實(shí)IL-23在CRSwNP表達(dá)增高，但其在NP中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究主要探討了IL-23因子在CRSsNP和CRSwNP中的表達(dá)及與Th17反應(yīng)的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

募集15例受試者(正常對(duì)照組)，14例CRSsNP患者(CRSsNP組)和37例CRSwNP患者(CRSwNP組)，取因解剖變異而進(jìn)行鼻中隔成形術(shù)的正常對(duì)照組受試者的下鼻甲，CRSsNP組患者的篩竇黏膜和CRSwNP組患者的NP組織。依據(jù)臨床檢查、鼻內(nèi)鏡和CT檢查結(jié)果確診CRSsNP和CRSwNP 病例[9]。本研究與前期研究的研究對(duì)象相同，研究對(duì)象的臨床特征詳見前期研究[10]。

1.2 組織勻漿的制備

組織勻漿的制備參考前期研究[10]。簡單處理過程為凍存的組織稱質(zhì)量，自動(dòng)勻漿機(jī)勻漿2 min，用含有1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))蛋白酶抑制劑的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液溶解，然后離心收集上清，-70 ℃保存，用于細(xì)胞因子IL-23、IL-17 和髓過氧化物酶(myelo-peroxidase, MPO)的檢測。

1.3 NP組織單個(gè)細(xì)胞懸液的制備和體外刺激

NP組織單個(gè)細(xì)胞懸液采用酶消化法制備，參考前期研究[11]。簡單的處理過程為將新鮮的NP組織用剪刀剪成小塊，然后移入Gentle MACs 管(Miltenyi Biotec公司, 德國)中，在Gentle MACs 儀器(Miltenyi Biotec公司，德國)上絞碎，離心收集絞碎的組織用2 mg/mL 膠原酶(Gibco Life Technologies公司, 英國)和0.04 mg/mL DNAse1(Roche Diagnostics公司, 德國)，37 ℃消化45 min，然后在Gentle MACs儀器上再次絞碎，離心收集細(xì)胞，70 μm 細(xì)胞篩(BD Falcon公司, 美國)過濾，裂解紅細(xì)胞后收集細(xì)胞。

將上述NP組織單個(gè)細(xì)胞用100 ng/mL的IL-23(R&D Systems公司，美國)刺激24 h，然后收集培養(yǎng)上清，后續(xù)檢測IL-17、IL-1β、IL-8和粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor,G-CSF)濃度。

1.4 細(xì)胞因子檢測

采用Luminnex 法檢測鼻黏膜組織IL-23、IL-17 和MPO濃度(Magnetic Luminex Performance Assay, R&D Systems; 美國)；NP組織單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-17、IL-1β、IL-8和G-CSF濃度(Bio-Rad公司, 美國)。

1.5 外周血中性粒細(xì)胞分析

外周血中性粒細(xì)胞數(shù)目和百分比采用標(biāo)準(zhǔn)的全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行分析。

1.6 組織中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

將鼻黏膜組織石蠟包埋后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining，HE)染色，然后隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(400×)，計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)目，表示為“平均中性粒細(xì)胞數(shù)目/高倍視野”。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果用GraphPad Prism 5.0 軟件包(Graphpad Software, San Diego, CA, 美國)分析。數(shù)據(jù)以M(P25,P75)表示。組間比較用Mann-WhitneyU-test，刺激前后比較用Wilcoxon signed rank test。相關(guān)分析采用Spearman法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-23在慢性鼻竇炎中的表達(dá)

與正常對(duì)照組相比，IL-23的濃度在CRSsNP組未見增高；CRSwNP組作為一個(gè)整體有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)。對(duì)照組15例中有0例IL-17陽性表達(dá)，14例CRSsNP組患者中只有4例IL-17陽性表達(dá)，而37例CRSwNP組患者中有23例IL-17陽性表達(dá)，因此，與正常對(duì)照組及CRSsNP組相比，CRSwNP組有明顯的IL-17亞群的存在。將CRSwNP組按照IL-17蛋白能否檢出進(jìn)一步分為IL-17-CRSwNP和IL-17+CRSwNP兩個(gè)亞組，可以看出IL-23在IL-17+CRSwNP組的表達(dá)顯著高于IL-17-CRSwNP組及正常對(duì)照組(圖1B)。

圖1 IL-23在CRSsNP和CRSwNP(A)及IL-17-CRSwNP和IL-17+CRSwNP(B)患者鼻黏膜組織勻漿的濃度

2.2 IL-23與中性粒細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示鼻黏膜組織IL-23濃度與MPO濃度呈正相關(guān)，但是與組織中性粒細(xì)胞的數(shù)目無相關(guān)性；與外周血中性粒細(xì)胞數(shù)目呈負(fù)相關(guān)，詳見表1。

表1 全部研究對(duì)象組織勻漿中IL-23濃度與中性粒細(xì)胞性指標(biāo)的相關(guān)性

IL-23: interleukin-23;MPO: myelo-peroxidase.

2.3 IL-23細(xì)胞因子體外對(duì)NP組織中Th17因子生成的調(diào)節(jié)

IL-17、IL-1β、IL-8和G-CSF為Th17免疫通路的重要因子。IL-23體外刺激NP組織單個(gè)細(xì)胞懸液能夠顯著上調(diào)IL-17和IL-1β的生成，但對(duì)IL-8和G-CSF的表達(dá)沒有影響(圖2)。

3 討論

以往研究[8]報(bào)道,NP組織IL-23陽性細(xì)胞數(shù)、IL-23蛋白水平和IL-23p19mRNA水平顯著高于正常鼻黏膜組織[8]。與此結(jié)果相似，筆者發(fā)現(xiàn)CRSwNP患者的NP組織IL-23蛋白水平有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。盡管歐洲的CRSwNP患者主要以Th2反應(yīng)為主，但是亞洲CRSwNP患者同時(shí)還存在Th17反應(yīng)[1]。因此，按照NP組織IL-17能否檢出，筆者將CRSwNP患者進(jìn)一步分為IL-17陽性和陰性兩個(gè)亞組，發(fā)現(xiàn)IL-17陽性CRSwNP組鼻黏膜組織IL-23蛋白水平顯著高于正常對(duì)照組和IL-17陰性CRSwNP組，提示IL-23可能參與了CRSwNP中的Th17反應(yīng)。

圖2 IL-23刺激對(duì)NP組織單個(gè)細(xì)胞中Th17相關(guān)因子生成的調(diào)節(jié)

盡管以往研究[5-7]報(bào)道，IL-23-Th17通路參與了多種疾病的發(fā)生，但是CRSwNP中IL-23與Th17反應(yīng)的關(guān)系尚未見報(bào)道，因此本研究對(duì)此做了進(jìn)一步的探討。由于NP組織單個(gè)細(xì)胞懸液能夠更好地模擬體內(nèi)NP的環(huán)境，本研究選擇此體系觀察了IL-23體外刺激對(duì)NP組織Th17反應(yīng)的影響。IL-17是Th17通路的主要效應(yīng)因子，可以誘導(dǎo)IL-8和G-CSF的生成，進(jìn)而募集中性粒細(xì)胞的聚集和活化，而IL-1β主要參與Th17細(xì)胞的分化[12-14]。本研究顯示，IL-23能夠增強(qiáng)IL-17和IL-1β的生成，但是對(duì)IL-8和G-CSF的生成沒有影響，支持IL-23對(duì)CRSwNP中的Th17反應(yīng)有正向調(diào)節(jié)作用。但是盡管Th17細(xì)胞是IL-17因子的主要來源，活化的CD8+T細(xì)胞[15]、中性粒細(xì)胞[16]和嗜酸性粒細(xì)胞[17]也能夠生成IL-17。NP組織單個(gè)細(xì)胞懸液雖然能夠更好地模擬體內(nèi)NP的環(huán)境，但是由于此體系是多種細(xì)胞的混合，無法確定IL-23誘導(dǎo)IL-17生成的具體細(xì)胞，需要后續(xù)用特定的細(xì)胞進(jìn)一步研究。

研究者[18-19]通常認(rèn)為Th17反應(yīng)能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)。而且，有研究[20]報(bào)道IL-23能夠不依賴IL-17促進(jìn)小鼠腸炎模型中中性粒細(xì)胞的募集。筆者觀察了組織IL-23濃度與中性粒細(xì)胞的關(guān)系，結(jié)果顯示，鼻黏膜組織IL-23濃度與MPO濃度呈正相關(guān)，但是與組織和外周血中性粒細(xì)胞的數(shù)目無相關(guān)性。而且，筆者的前期研究[11]結(jié)果顯示，IL-17濃度也與MPO濃度呈正相關(guān)，但是與組織和外周血中性粒細(xì)胞的數(shù)目無相關(guān)性。與此一致，Choy等[21]在Th17亞型的哮喘中也未觀察到外周和組織中中性粒細(xì)胞數(shù)目的增多，這些結(jié)果支持Th17炎性反應(yīng)中中性粒細(xì)胞的活性可能比數(shù)目更重要。

總之，IL-23在CRSsNP和IL-17陰性CRSwNP的發(fā)生中可能沒有發(fā)揮作用，但可能通過調(diào)節(jié)Th17通路參與了IL-17陽性CRSwNP的發(fā)生。