方桂村 張碧君 趙彥艷

中國醫(yī)科大學(xué)（沈陽110122）

耳聾是最常見的出生缺陷之一，臨床上以聽力喪失為唯一癥狀的非綜合征為主，部分合并其他系統(tǒng)異常綜合征[1]，常見的突變導(dǎo)致非綜合性耳聾的基因有GJB2、SLC26A4和線粒體DNA 12SrRNA(m.1555A＞G和m.1494C＞T)，這3個基因已作為臨床耳聾的常規(guī)檢查基因。2017年，天津市婦嬰兒童保健院的肖彩霞等人對94例非綜合征性聽力障礙兒童進(jìn)行常見耳聾基因(GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體12SrRNA)共20個突變位點的檢測，SLC26A4(PDS)基因陽性例數(shù)15例，皆位于雙側(cè)聽力下降組，其中純合突變者5例(皆位于IVS7-2A＞G位點)，復(fù)合雜合突變者4例，雜合突變者6例，檢出率高達(dá)15.96%僅次于GJB17.02%[2]。

Pendrin（slc26a4），一種參與CL-/HCO3-以及一些陰離子轉(zhuǎn)運的轉(zhuǎn)運蛋白。Pendrin基因突變可以導(dǎo)致彭德萊綜合征（Pendred syndrome，PDS）也稱為家族性呆小聾啞癥，主要臨床癥狀表現(xiàn)為感覺神經(jīng)性聽力喪失，甲狀腺腫等癥狀[3]。多項研究表明該基因突變與彭德萊綜合征和前庭水管擴大（Large vestibular aqueduct syndrome，LVAS）或內(nèi)耳畸形有密切的關(guān)系[4,5]。有文章估計,世界范圍內(nèi)兒童語前聾患者中4%～10%由Pendred綜合征導(dǎo)致，在耳聾患者中前庭水管擴大占有很高的比例[6]，我國有關(guān)PDS致病機制的報道還不夠豐富，但足以看出Pendrin在耳聾的發(fā)生以及發(fā)展方面起著不可忽視的作用。在我們對Pendrin蛋白研究過程中發(fā)現(xiàn)Pendrin作為膜蛋白可能是一種泛素E3連接酶Nedd4L的底物，Nedd4L（Neural precursor cell expressed developmentally downregulated gene 4-like）是一種常見的泛素E3連接酶，Nedd4L可以通過泛素化特異底物從而影響其細(xì)胞定位，進(jìn)入蛋白酶體降解途徑，改變其功能活性。其中研究較為成熟的是ENaC，Nedd4L的缺失可以導(dǎo)致ENaC的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而引起血液離子滲透壓的改變而影響血壓[7]。

Zhong SX和Liu ZH團(tuán)隊分別在2009和2014年檢測了Nedd4L在大鼠和豚鼠耳蝸中的表達(dá)，結(jié)果顯示Nedd4L在耳蝸中的表達(dá)非常廣泛[8,9]，同時Pendrin在耳蝸及前庭導(dǎo)水管中的表達(dá)已經(jīng)得到了許多報道和研究的驗證[10-12]。通過生物信息網(wǎng)站預(yù)測，Nedd4L與底物結(jié)合需要識別特定的氨基酸序列，稱之為PY蛋白模序，序列由PPXY/LPXY組成，其中X代表任意氨基酸[13]。Pendrin的氨基酸序列在靠近N端存在兩個PY模序，這使我們有理由猜測Pendrin可能被Nedd4L識別并介導(dǎo)其發(fā)生泛素化修飾。為了探究Pendrin是否屬于Nedd4L的底物以及明確Nedd4L對Pendrin的調(diào)節(jié)作用，我們構(gòu)建了Nedd4L表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,闡明Nedd4L對Pendrin的泛素化修飾調(diào)節(jié)作用機制以及明確對Pendrin在293T細(xì)胞中的表達(dá)和定位的影響，為進(jìn)一步研究Pendrin在耳聾發(fā)生發(fā)展中的作用提供新的實驗數(shù)據(jù)以及在治療耳聾方面提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 用于PCR克隆的引物與模板

擴增引物：

5'-CGAGCTCAAGCTTCGAATTCCGCCACCATGGCGACCGGGCTCGGGGAGCCGGT-3'

5'-TGGTGGCGACCGGTGGATCCCGATCCACCCCTTCAAATCCTTGAGCATTTTC-3'

AAATCCTTGAGCATTTTC-3'測序引物：

5'-GTTCTTCTTACTGTCCAAAG-3'

5'-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-3'

根據(jù)PrimerPremier6設(shè)計引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并PCR擴增目的片段，引物合成以及測序服務(wù)由上海生工以及金唯智生物科技有限公司完成。

1.1.2 實驗試劑

Nedd4L、Pendrin蛋白抗體（abcam公司）；PCR及反轉(zhuǎn)錄試劑（日本Takara公司）；細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染相關(guān)生物學(xué)試劑（以色列BI公司、美國Biosharp公司）Western印跡相關(guān)試劑（碧云天生物技術(shù)公司、美國Millipore公司、美國Promega等）；熒光顯微鏡為萊卡公司；Co-IP免疫磁珠（bimake），JM109感受態(tài)細(xì)菌購自Takara公司，引物合成以及測序服務(wù)由上海生工以及金唯智生物科技有限公司完成；核酸內(nèi)切酶以及PCR擴增相關(guān)試劑購自Takara；膠回收以及質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen生物公司。真核表達(dá)載體GV230（吉凱基因）。其他常用無機化學(xué)試劑均購自索萊寶及碧云天公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

293T細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（BI）常規(guī)培養(yǎng)，37℃、5%CO2及100%濕度的條件下培養(yǎng)。密度大于90%后以0.20%的胰酶(PBS配制)消化并傳代。

1.2.2 Western Blot實驗

細(xì)胞中總蛋白的提取，293T細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（10%fetal serum，1%青鏈霉素），37℃、5%CO2及100%濕度的條件下培養(yǎng)，0.20%胰酶消化細(xì)胞并傳代。轉(zhuǎn)染72小時后進(jìn)行下一步操作。細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞，在冷PBS中洗滌3次，2500 rpm離心5 min。加入100 μl蛋白裂解液（含1%PMSF），置于冰上，裂解30 min。4℃ 12000 rpm離心10 min，取上清，分裝并于-70℃保存。細(xì)胞膜蛋白分離，培養(yǎng)約2000-5000萬細(xì)胞，用PBS洗一遍，用細(xì)胞刮子刮下細(xì)胞或用含有EDTA但不含胰酶的細(xì)胞消化液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，吸除上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的膜蛋白。用適量冰浴預(yù)冷的PBS輕輕重懸細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計數(shù)，剩余細(xì)胞4℃600g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。棄上清，隨后4℃600g離心1分鐘，以沉淀離心管管壁上的殘留液體并進(jìn)一步沉淀細(xì)胞，盡最大努力吸盡殘留液體。將離心管置于液氮中，至全部沉淀變?yōu)榧儼咨ü虘B(tài)，約10s），在室溫融化，反復(fù)2-3次，去少量鏡下觀察，可以看到細(xì)胞70%以上破碎，4℃700g離心10分鐘，小心收集上清液至一新的離心管中。吸取上清時切勿接觸沉淀！可以有約30-50μL上清液殘留不予吸取，以保證吸取的上清液有較高的純度。4℃14000g離心30分鐘，以沉淀細(xì)胞膜碎片。吸取上清即為細(xì)胞漿蛋白，可-70℃保存?zhèn)溆?。吸取上清時可以有30-50μL上清殘留，以避免接觸沉淀導(dǎo)致上清樣品被污染。4℃14000g離心10秒，盡最大努力吸盡上清?？梢暂p輕觸碰到沉淀，甚至吸走很少量的沉淀。加入膜蛋白抽提試劑B 200μL(如有必要，也可以加大到300μL)，最高速劇烈Vortex 5秒重懸沉淀，冰浴5-10分鐘。重復(fù)前述步驟的vortex和冰浴孵育1-2次，以充分抽提膜蛋白。隨后，4℃14000g離心5分鐘，收集上清即為細(xì)胞膜蛋白溶液?？?70℃保存?zhèn)溆?。膜蛋白提取試劑全部來自碧云天公司（p0033）。

10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳；轉(zhuǎn)膜，4℃100V轉(zhuǎn)印約1～2h。封閉液封閉和抗體的雜交，將PVDF膜取出，PBS洗3次，5min/次，1%封閉液于室溫封閉PVDF膜2 h；TBST洗膜3次，5 min/次，加入適當(dāng)比例稀釋的一抗的雜交液，標(biāo)記一抗（abcom），于4℃孵育過夜；次日TBST洗膜3次，5 min/次，加入1:5000稀釋的辣根過氧化物酶雜交液，標(biāo)記二抗，于室溫孵育1.5 ～ 2 h；TBST洗膜3次，5 min/次；用ECL kit發(fā)光（Abbkine），掃描灰度，并利用Image J軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 免疫共沉淀

取293T細(xì)胞新鮮蛋白200μg分別與Nedd4L（2μg）、Pendrin（2μg）和Ub抗體（1μg）置于已渦旋混勻的磁珠（35μL）（bimake）和 binding buffer（200μL）中，常溫旋轉(zhuǎn)10min或4℃旋轉(zhuǎn)過夜，用配置好的washing buffer洗滌兩遍，最后一次洗滌吸取上清液，加入50 μL 1x蛋白loadingbuffer，100℃沸水浴變性5min將EP管放置于磁力架上，吸取上清液。之后用Western印記雜交實驗。

1.2.4 Nedd4L真核表達(dá)載體構(gòu)建

在NCBI GeneBank上查找Nedd4L的cDNA序列，根據(jù)PrimerPremier6設(shè)計引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并PCR 擴增目的片段；反應(yīng)體系：ddH2O32.5 μL，5XPS Buffer10 μL ，dNTP Mix（2.5mM each）4 μL，上游引物（10μM）1 μL，下游引物（10μM）1 μL，模板（10ng/μL）1μL，PrimeSTAR HS DNA polymerase0.5 μL，總體積 50 μL。反應(yīng)條件：98℃ 5min，95℃10sec，55℃ 10sec，72℃ 30sec，72℃ 8min，4℃∞，循環(huán)30次。對目的片段以及空載體進(jìn)行酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，T4連接酶連接過夜。次日進(jìn)行轉(zhuǎn)化將全部連接產(chǎn)物加入到50 μLJM109感受態(tài)細(xì)胞中（Takara），輕混，冰上放置30min，42℃水浴熱休克1min，冰上放置5min，加入900 μLLB培養(yǎng)基，37℃搖床慢搖（100rpm）20min，快轉(zhuǎn) 40min（160rpm）。3000rpm離心1min，留約 30-50 μLLB培養(yǎng)基，重懸，將菌液涂于含有氨芐抗性的LB瓊脂板，37℃過夜。次日挑取單個菌落，將菌落與槍頭一同置入15mL離心管，加入10mLLB培養(yǎng)基，160rpm，搖床37℃過夜（10～16h），用質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen）提取質(zhì)粒，用合成引物PCR，將PCR產(chǎn)物測序驗證。實驗所有相關(guān)酶全部購自Takara公司。

1.2.5 轉(zhuǎn)染

細(xì)胞接種于6孔板，生長密度達(dá)到70%；以每孔2 μg、200μL jetPRIME buffer加入至EP管中，渦旋混勻；以每孔4μL加入jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑，渦旋；室溫孵育10min；每孔加入200μL混合液；37℃培養(yǎng)4h后換液。

1.2.6 免疫熒光

將細(xì)胞接種于預(yù)先放好蓋玻片的六孔板中，24h，生長至細(xì)胞密度60%，轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后72小時，將玻片取出，預(yù)冷PBS洗三遍，加入4%多聚甲醛固定十分鐘，PBS洗三遍，加入抗體稀釋液中（1%BSA：抗體=1000：1～500：1），4℃過夜，PBS洗三遍，加入二抗，室溫孵育1h（避光），PBS洗三遍，載玻片上滴50μL甘油，將玻片倒扣于甘油上，Leica DMI 4000 B熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 統(tǒng)計分析

SPSS17.0軟件統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)均由至少三次獨立實驗結(jié)果的均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 證實Pendrin可與Nedd4L和泛素在體內(nèi)結(jié)合

利用免疫磁珠法及Western印記雜交，檢測到Nedd4L與Pendrin存在體內(nèi)結(jié)合（圖1a和1b），同樣的方法，我們檢測到Pendrin可以與泛素結(jié)合（圖1c和1d），這兩個結(jié)果表明，Pendrin可能是泛素E3連接酶Nedd4L的底物并在其作用下發(fā)生泛素化修飾。

圖1 a、b、c、d為免疫共沉淀Western Blot檢測結(jié)果 a，b為Pendrin與Nedd4L相互結(jié)合的Co-IP結(jié)果，可見Pendrin可以與Nedd4L在胞內(nèi)相互結(jié)合。c，d為Pendrin與泛素Ub-Co-IP結(jié)果，可見Pendrin在胞內(nèi)與泛素存在相互結(jié)合。Fig.1 a,b,c and d were the results of immunoprecipitation Western Blot test a and b were the results of Co-IP of Pendrin and Nedd4L,which showed that Pendrin and Nedd4L could bind to each other in cells.c and d are the results of Pendrin and ubiquitin UbCo-IP.It can be seen that Pendrin binds to ubiquitin in cells.

2.2 過表達(dá)Nedd4L能夠促進(jìn)Pendrin泛素化修飾

為了研究Nedd4L與Pendrin的結(jié)合對Pendrin泛素化程度的影響，我們構(gòu)建的Nedd4L的真核表達(dá)載體，將整段Nedd4L插入至GV230空載體中，重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后通過公司測序，證實序列與目標(biāo)序列一致，無突變，并利用熒光及Western Blot技術(shù)檢測質(zhì)粒在293T細(xì)胞中表達(dá)良好（圖2a）；Western印記雜交檢測轉(zhuǎn)染72h 293T細(xì)胞Nedd4L表達(dá)明顯升高（t=2.571，P=0.034）（圖2b）。利用免疫共沉淀技術(shù)檢測到Pendrin在過表達(dá)Nedd4L72h后，泛素化程度明顯高于對照組，（t=2.571，P=0.049）轉(zhuǎn)染前后泛素化程度具有明顯差異。（圖2c）。

2.3 過表達(dá)Nedd4L能夠下調(diào)Pendrin在293T中的表達(dá)

為了探究Nedd4L與Pendrin在體內(nèi)的相互作用，我們用構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72h后收集總蛋白，膜蛋白以及漿蛋白，Western印記雜交檢測，發(fā)現(xiàn)，在293T細(xì)胞中過表達(dá)Nedd4L能夠?qū)е翽endrin表達(dá)下降，（t=2.571，P=0.0422，P=0.0143，P=0.0073）（圖3a），膜蛋白下降較漿蛋白顯著，（t=2.306，P=0.0129）（圖3b），這表示Nedd4L很可能在結(jié)合Pendrin后促使其發(fā)生泛素化修飾并通過泛素蛋白酶體途徑或者溶酶體途徑發(fā)生降解。

圖2 a從左至右分別是轉(zhuǎn)染72h后DAPI染色熒光、EGFP熒光和Merge；b轉(zhuǎn)染72h后Western檢測Nedd4L過表達(dá)情況（NC為空載體轉(zhuǎn)染對照組，下同）；c Western印記雜交，免疫共沉淀檢測Pendrin轉(zhuǎn)染前后泛素化修飾程度變化。Fig.2 a From left to right,DAPI staining fluorescence,EGFP fluorescence and Merge were detected 72 hours after transfection;b Western was used to detect the overexpression of Nedd4L(NC was empty vector transfection control group,the same below);c Western blot hybridization,immunoprecipitation was used to detect the changes of Pendrin ubiquitination modification before and after transfection.

圖3 a轉(zhuǎn)染48、72、96h后Pendrin在293T細(xì)胞中表達(dá)降低b轉(zhuǎn)染72h后Pendrin在293T膜蛋白中表達(dá)降低。Fig.3 a Pendrin expression decreased in 293T cells 48,72 and 96 hours after transfection；b Pendrin expression decreased in 293T membrane protein 72 hours after transfection.

3 討論

泛素化是一類廣泛存在于機體中的翻譯后修飾，被泛素標(biāo)記的蛋白或肽段會被蛋白酶體識別并發(fā)生部分甚至全部水解也有部分進(jìn)入溶酶體途徑，這兩種蛋白降解方式是細(xì)胞中最為常見且在維持細(xì)胞正常代謝，生長分化不可或缺的重要生物反應(yīng)過程。Nedd4L作為泛素E3連接酶，HECT家族中的成員之一，Nedd4L的缺失會導(dǎo)致小鼠患上鹽敏感性高血壓，主要原因是腎臟喪失了由Na+通道蛋白EnaC介導(dǎo)的的調(diào)節(jié)對水鹽作用；除了高血壓，Nedd4L介導(dǎo)的K+轉(zhuǎn)運體以及Cl-轉(zhuǎn)運體泛素化失衡，也將引起一系列酸、堿血癥[14-16]，經(jīng)其泛素化修飾的蛋白中有很大一部分屬于離子轉(zhuǎn)運蛋白，其中有許多已被證實的可以由Nedd4L介導(dǎo)泛素化降解，如EnaC、NCC、NKCC1和NKCC2等Na+、CL-相關(guān)轉(zhuǎn)運蛋白，還有NHE3等PH，滲透壓相關(guān)離子轉(zhuǎn)運及通道蛋白[17-22]而Pendrin便是一種重要的陰離子轉(zhuǎn)運蛋白，Pendrin基因突變可以導(dǎo)致彭德萊綜合征（PDS）也稱為家族性呆小聾啞癥，主要臨床癥狀表現(xiàn)為感覺神經(jīng)性聽力喪失，甲狀腺腫等癥狀。其在在臨床上，Pendrin已經(jīng)是特定的先天耳聾基因檢測位點。Pendrin基因突變導(dǎo)致的Pendrin蛋白功能缺陷會引起內(nèi)耳發(fā)育畸形，出生前以及出生后的發(fā)育階段Pendrin的表達(dá)以及功能顯得十分關(guān)鍵。近年來對于Pendrin對HCO3-的轉(zhuǎn)運功能也逐漸得到認(rèn)識，腎上腺中的Pendrin功能似乎支持醛固酮的分泌，抑制其表達(dá)可能有助于減少腎鹽重吸收以及醛固酮的其他腎外作用[23]。在此之前，Nedd4L對Pendrin的泛素化修飾作用以及Pendrin在耳聾疾病中的泛素化相關(guān)研究至今罕為報道，通過我們對Nedd4L與底物特異識別方式的理解，氨基酸序列中PY模序的存在是底物能夠被Nedd4L識別的重要結(jié)構(gòu)，在對Pendrin蛋白氨基酸序列研究的過程中我們發(fā)現(xiàn)了在Pendrin的N端存在一個PY模序，結(jié)合已有Nedd4L底物中存在眾多離子通道蛋白的特點，我們推測Pendrin可能與Nedd4L存在直接作用，并由Nedd4L介導(dǎo)發(fā)生泛素化修飾。

本實驗在293T細(xì)胞中首次證明了Nedd4L能夠與Pendrin結(jié)合并促進(jìn)其泛素化，為了探究Nedd4L促進(jìn)Pendrin泛素化修飾后對于Pendrin的影響，我們構(gòu)建了Nedd4L的表達(dá)載體，在293T細(xì)胞中過表達(dá)Nedd4L，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Nedd4L后，誘導(dǎo)Pendrin表達(dá)下降，其中漿蛋白降低程度不如膜蛋白明顯，其原因可能是被泛素化修飾后，Pendrin被蛋白酶體識別，發(fā)生水解，從細(xì)胞膜內(nèi)化至胞質(zhì)，進(jìn)一步水解或保持失活狀態(tài)，而并非全部Pendrin分子內(nèi)化后都發(fā)生降解。綜上，本實驗發(fā)現(xiàn)了Pendrin可以作為Nedd4L的底物的同時發(fā)現(xiàn)Nedd4L能夠促進(jìn)Pendrin發(fā)生泛素化修飾并發(fā)生內(nèi)化降解。上述結(jié)果為研究Pendrin在先天耳聾發(fā)生以及發(fā)展提供了新的研究方向，并為治療彭德萊綜合征提供新的理論基礎(chǔ)。