吳昆哲，戴冬秋

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院胃腸外科，沈陽 110032）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國惡性腫瘤發(fā)病率中居第2位，死亡率中居第3位，且在新發(fā)病例中超過90%為中晚期胃癌［1］。盡管近年胃癌手術(shù)和藥物治療的效果有了很大的提升，但是胃癌極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且晚期胃癌患者預(yù)后較差［2］。據(jù)報(bào)道，胃癌患者的5年生存率較低，2010年至2014年我國胃癌患者5年生存率僅為35.9%，較2000年至2004年的30.2%并未明顯改善，這嚴(yán)重地危害了胃癌患者的生命健康［3］。胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，受多種因素的調(diào)控，如促癌基因激活或抑癌基因失活均可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞惡性增殖。因此，探索新的胃癌相關(guān)基因，對(duì)胃癌的治療和預(yù)后具有重要意義。

富含半胱氨酸型運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白1 （cysteinerich motor neuron 1，CRIM1）是一類糖基化的Ⅰ型跨膜蛋白，可以調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白 （bone morphogenetic protein，BMP） 的表達(dá)。相關(guān)研究［4］表明，CRIM1在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用，CRIM1過表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并延長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞周期。目前，CRIM1在胃癌中的作用仍未有報(bào)道。因此，本研究旨在通過沉默CRIM1基因探討其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為胃癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購自中科院上海細(xì)胞庫；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；脂質(zhì)體Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；MTT購自美國Sigma公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司；兔抗人GAPDH抗體、CRIM1抗體、BCL-2抗體、BAX抗體均購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自博奧森生物公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息數(shù)據(jù)庫分析：基因表達(dá)譜交互式分析網(wǎng)站（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）是一個(gè)基于癌癥基因組圖譜 （cancer genome atlas，TCGA） 和基因型－組織表達(dá)項(xiàng)目 （the genotype-tissue expression project，GTEx） 中的數(shù)據(jù)，用于分析RNA測(cè)序的交互式Web服務(wù)器［5］。利用GEPIA網(wǎng)站中TCGA數(shù)據(jù)分析CRIM1基因在胃癌組織 （408例） 和癌旁正常組織 （36例） 中的表達(dá)水平。利用生物數(shù)據(jù)軟件Kaplan-Meier plotter （http：//kmplot.com/analysis/） 的胃癌數(shù)據(jù)集，分析CRIM1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。篩選條件：（1） mRNA RNA-seq：gastric cancer；（2） Probe set options：all probe sets per gene；（3） Gene symbol：CRIM1，其他選項(xiàng)按默認(rèn)設(shè)置，共納入876例患者數(shù)據(jù)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞AGS購自中科院上海細(xì)胞庫，使用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗混合液的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于含5% CO2、恒溫37 ℃的細(xì)胞孵育箱中。每1～2 d更換1次培養(yǎng)液，并按1 ∶2的比例每2～3 d傳代1次。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d將1×106個(gè)AGS細(xì)胞接種于6孔板中，置于37 ℃的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)24 h后，使用脂質(zhì)體Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA），沉默CRIM1基因表達(dá)，所用siRNA片段由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)合成。轉(zhuǎn)染分為3組：空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組 （si-NC組） 和陽性轉(zhuǎn)染組 （si-CRIM1組）。采用Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后在細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)48 h，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：取轉(zhuǎn)染后各組AGS細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至3×103/mL并接種于96孔板中，置于恒溫37 ℃的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)48 h。每孔加入濃度為5 mg/mL的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去每孔中的上清液，隨后向每孔加入150 μL DMSO，振蕩混勻15 min后在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上檢測(cè)各孔在450 nm處讀數(shù)，將光密度值 （optical density，OD） 視為細(xì)胞的密度，每組至少5 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，將si-CRIM1組與si-NC組OD值的比值視為siRNA轉(zhuǎn)染后AGS細(xì)胞的增殖率。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的凋亡率：取各組AGS細(xì)胞分別接種于6孔板中，并置于37 ℃、5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。隨后用PBS漂洗，用不含EDTA的胰酶消化，收集細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105/mL。向每孔中加入500 μL連接緩沖液使細(xì)胞重懸，隨后每孔分別加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和5 μL碘化丙啶染液，常溫避光繼續(xù)孵育10 min。將樣品置于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，每組檢測(cè)1×105個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)：轉(zhuǎn)染24 h后收集各組細(xì)胞，使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，并以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，保存于-80 ℃冰箱中，BCA法測(cè)蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳 （80～120 V），100 V轉(zhuǎn)膜1 h后，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液清洗3次，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃室溫振蕩1 h，再次TBST緩沖液清洗3次。滴加ECL顯影劑，并曝光，應(yīng)用Image J軟件分析各組蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 生物信息數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果

利用GEPIA網(wǎng)站獲取CRIM1mRNA在408例胃癌組織和36例癌旁正常組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，胃癌組織中CRIM1mRNA的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，見圖1A。利用生物數(shù)據(jù)軟件Kaplan-Meier plotter分析CRIM1基因表達(dá)與胃癌患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果顯示，CRIM1基因低表達(dá)患者的生存期顯著高于CRIM1基因高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P=0.004 8），見圖1B。

圖1 CRIM1在胃癌中的表達(dá)情況以及CRIM1表達(dá)水平與胃癌患者總生存期的生存曲線Fig.1 Expression levels of CRIM1 in gastric cancer and survival curves of patients with gastric cancer

2.2 si-CRIM1沉默

si-NC組與空白對(duì)照組比較，AGS細(xì)胞中CRIM1蛋白表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞ 0.05），而si-CRIM1組與空白對(duì)照組、si-NC組比較，AGS細(xì)胞中CRIM1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （分別為P=0.037，P=0.042），表明胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA后CRIM1基因被沉默。見圖2。

2.3 沉默CRIM1表達(dá)降低AGS細(xì)胞的增殖率

圖2 3組CRIM1蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Expression levels of CRIM1 protein in the three groups

MTT結(jié)果表明，si-CRIM1組中AGS細(xì)胞增殖率明顯低于空白對(duì)照組、si-NC組，且96 h時(shí)si-CRIM1組與空白對(duì)照組、si-NC組比較，AGS細(xì)胞增殖能力的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （分別為P=0.035，P=0.042）。見圖3。

2.4 沉默CRIM1表達(dá)促進(jìn)AGS細(xì)胞的凋亡率

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，空白對(duì)照組、si-NC組、si-CRIM1組中胃癌細(xì)胞凋亡率分別為（9.85±0.45） %、（10.74±0.73） %、（18.42±0.57） %，與空白對(duì)照組和si-NC組比較，si-CRIM1組中AGS細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。見圖4。

2.5 沉默CRIM1表達(dá)對(duì)AGS細(xì)胞中BCL-2、BAX蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果表明，si-CRIM1組AGS中凋亡相關(guān)蛋白BCL-2的相對(duì)表達(dá)量明顯低于空白對(duì)照組和si-NC組 （分別為P=0.041，P=0.035），而凋亡相關(guān)蛋白BAX的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組和si-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為P=0.025，P=0.033）。見圖5。

3 討論

胃癌是世界上第三大常見的惡性腫瘤，其死亡率在世界范圍內(nèi)的腫瘤致死率中居第5位［6］。盡管近年來胃癌的治療策略有了很大的改善，但胃癌患者的預(yù)后仍然很不樂觀，其主要原因是胃癌的迅速進(jìn)展與復(fù)發(fā)［7］。胃癌細(xì)胞獲得較強(qiáng)的增殖能力和抗凋亡能力是導(dǎo)致胃癌迅速進(jìn)展的主要原因。因此，找到與胃癌細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的關(guān)鍵基因，可以為胃癌的靶向治療提供新的分子靶點(diǎn)。目前，諸多基因已被報(bào)道參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但仍未有文獻(xiàn)報(bào)道CRIM1基因在胃癌中的作用。因此，本研究旨在通過沉默CRIM1基因探討其在胃癌增殖和凋亡方面的作用。

圖3 沉默CRIM1后3組細(xì)胞的增殖情況Fig.3 Proliferation of AGS cells in the three groups after silencing CRIM1

圖4 沉默CRIM1后3組細(xì)胞的凋亡率Fig.4 Apoptosis rates of AGS cells in the three groups after silencing CRIM1

圖5 Western blotting 檢測(cè)CRIM1沉默后3組AGS細(xì)胞的BCL-2和 BAX蛋白水平Fig.5 BCL-2 and BAX protein levels in AGS cells in the three groups detected by Western blotting after silencing CRIM1

CRIM1基因最早被報(bào)道與神經(jīng)組織的發(fā)育有關(guān)，且在神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)建中起著重要作用［8］。CRIM1基因位于人類第2號(hào)短臂染色體上 （2p22.2），其翻譯蛋白質(zhì)量約為114×103。CRIM1是一種跨膜蛋白，含有胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白功能和多個(gè)富半胱氨酸區(qū)域［10］。富半胱氨酸區(qū)域被認(rèn)為可以與BMP特異性結(jié)合，CRIM1則可以通過富半胱氨酸區(qū)域結(jié)構(gòu)抑制BMP前蛋白向成熟蛋白的轉(zhuǎn)化［11］。近年來，BMP被報(bào)道在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和血管生成中起著重要作用［12］。CRIM1作為BMP拮抗因子，逐漸顯現(xiàn)其在腫瘤中的作用。早期研究［13-15］證明，CRIM1在腎癌、肺癌、白血病等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，且與腫瘤的發(fā)生、增殖、凋亡和患者預(yù)后顯著相關(guān)。此外，有研究［9］證實(shí)敲低CRIM1基因可以降低細(xì)胞與細(xì)胞以及細(xì)胞與基質(zhì)的連接作用，從而抑制細(xì)胞的增殖。以上研究結(jié)果表明，CRIM1基因在多種惡性腫瘤中為促癌基因，但CRIM1在胃癌中的作用尚不明確。

本研究首先使用GEPIA平臺(tái)中TCGA數(shù)據(jù)分析CRIM1基因，結(jié)果顯示，CRIM1mRNA表達(dá)水平在胃癌組織中顯著高于正常胃黏膜上皮組織。此外，利用在線數(shù)據(jù)庫Kaplan-Meier plotter分析CRIM1mRNA表達(dá)與胃癌患者總生存期的關(guān)系，結(jié)果表明，CRIM1mRNA高表達(dá)的胃癌患者總生存期較差。通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，將沉默CRIM1的siRNA轉(zhuǎn)染至胃癌AGS細(xì)胞中，探究下調(diào)CRIM1基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。MTT和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，沉默CRIM1基因表達(dá)后AGS細(xì)胞的增殖率顯著降低，而凋亡率明顯升高。Western blotting 結(jié)果顯示，沉默CRIM1基因表達(dá)可以抑制AGS細(xì)胞中BCL-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)升高BAX蛋白表達(dá)，進(jìn)一步說明CRIM1基因可能調(diào)控胃癌細(xì)胞凋亡過程。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，高表達(dá)的CRIM1基因與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)，并且該基因可能通過調(diào)控增殖和凋亡相關(guān)因子在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。本研究為探究CRIM1在胃癌細(xì)胞增殖和凋亡中的作用提供了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。未來將進(jìn)一步深入研究CRIM1基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制，從而為胃癌的基因靶向治療創(chuàng)造更多可能。