張朦朦，劉雪娜，來永巍，劉 玥，何紅鵬

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津300457)

宮頸癌是世界范圍內(nèi)威脅女性健康的第二大惡性腫瘤，我國每年約有10萬新發(fā)病例[1]．宮頸癌的發(fā)病與高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染密切相關，HPV病毒 DNA存在于約97%宮頸癌細胞中[2]．應用 siRNA、shRNA 以及CRISPR-CAS9敲減或敲除宮頸癌細胞中 HPV基因可抑制癌細胞生長，因此 HPV基因成為宮頸癌治療的靶標[3-6]．

在哺乳動物細胞中，染色質的最小結構單位是核小體，由組蛋白和 DNA構成．細胞內(nèi)組蛋白存在乙?；榷喾N形式的翻譯后修飾，這些翻譯后修飾對基因表達發(fā)揮調控作用．細胞內(nèi)蛋白質乙?；腿ヒ阴；^程分別由組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase，HAT)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase complex，HDAC)催化[7]．

在宮頸癌細胞中，HDAC表達水平升高活性增強，促進細胞癌變．因此，HDAC抑制劑是具有抗癌潛能的藥物[8-9]．SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)又稱伏立諾他(vorinostat)，是美國 FDA批準用于皮膚 T細胞淋巴瘤治療的 HDAC抑制劑.在宮頸癌領域，多個研究發(fā)現(xiàn) SAHA與常規(guī)化療藥物或放療方法聯(lián)合應用時能增強癌細胞對化療及放療的敏感性，抑制癌細胞增殖，促進癌細胞凋亡[10-13].但是，SAHA單獨應用在宮頸癌細胞中會產(chǎn)生怎樣的生物學效應，特別是對細胞衰老和遷移的影響，目前沒有文獻報道．

鑒于 HPV基因對宮頸癌的重要性，本實驗室前期研究了 SAHA對宮頸癌細胞中 HPV基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)SAHA抑制HPV基因表達并引起細胞周期阻滯[14]．然而，SAHA 對宮頸癌其他癌細胞表型的作用并不明確，因此，本課題從細胞凋亡、細胞衰老和細胞遷移這些方面進行深入研究．

1 材料與方法

1.1 材料

宮頸癌細胞 HeLa來自美國 ATCC．胎牛血清，天津康源生物技術有限公司；細胞完全培養(yǎng)基DMEM-LG，美國Gibco公司；SAHA，美國 Sigma公司；p21抗體、十字孢堿(ST)及細胞衰老 β-半乳糖苷酶染色試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑、M-MLV逆轉錄試劑盒，美國 Invitrogen公司；Fluorometric TUNEL System試劑盒，Promega公司；SYBR Green染料，德國DBI 公司；青霉素、鏈霉素、胰酶及 RNase A，北京索萊寶科技有限公司；MYL9抗體、β-actin抗體，Santa Cruz公司；山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗，美國LI-COR公司．

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

宮頸癌 HeLa細胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、100U/mL青霉素、0.1mg/mL鏈霉素的 DMEM-LG培養(yǎng)基，在 37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)．待細胞匯合度達到 70%～80%時，采用 0.25%胰酶溫和消化傳代．

1.2.2 臺盼藍染色計細胞數(shù)

等量的HeLa細胞接種于6孔板，加藥處理24h后用胰酶消化下來制備成單細胞懸液，并適當稀釋．細胞懸液與 0.4%臺盼藍溶液以 9﹕1混勻，孵育3min后，在顯微鏡下用血球計數(shù)板分別計數(shù)活細胞和死細胞，死細胞被染成淡藍色，而活細胞拒染．

1.2.3 β-半乳糖苷酶法檢測細胞衰老

HeLa細胞用 SAHA處理 72h后，用細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，按說明書檢測衰老相關β-半乳糖苷酶活性．用染色固定液室溫固定 15min，PBS漂洗后加入含有 X-Gal的染色工作液，37℃孵育過夜．在光學顯微鏡下觀察并拍照．

1.2.4 免疫印跡(Western blot)分析

提取細胞總蛋白，進行瓊脂糖凝膠電泳(SDSPAGE)檢測．通過半干電轉移法將蛋白轉移至硝酸纖維素膜．用封閉液室溫封閉 1h，繼之分別用 p21抗體、MYL9抗體、β-actin抗體孵育，4℃過夜，洗膜后加入相對應的二抗(山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗)室溫避光孵育 1.5～2h，洗膜 3次，用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜．

1.2.5 PCR檢測

4℃條件下用 Trizol裂解細胞，提取總 RNA，進行逆轉錄得到 cDNA，隨后進行常規(guī) PCR或實時熒光定量PCR(Real-time PCR)．引物序列為GAPDH：上游 5'-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3'，下游 5'-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3'；18SrRNA，上游5'-CACGGGAAACCTCACCCGGG-3'，下游 5'-CGGG TGGCTGAACGCCACTT-3'；MYL9，上游 5'-ATTCA ACGGCACAGTCAAGG-3'，下游 5'-GCAGAAGGGG CGGAGATGA-3'；p21，上游 5'-GACACCACTGGAG GGTGACT-3'，下游 5'-CAGGTCCACATGGTCTTCC T-3'．PCR 反應條件：95℃ 5min；95℃變性 30s，56℃退火 30s，72℃延伸 30s，28次循環(huán)；72℃10min．Real-time PCR 反應條件：95℃預變性2min；95℃變性 10s，60℃退火 30s，95℃延伸1min，40個循環(huán)；95℃ 10s 終止反應并以 ΔΔCt法對結果進行計算．

1.2.6 細胞劃痕實驗

將狀態(tài)良好的 HeLa細胞接種于 24孔板，培養(yǎng)24h后用小號槍頭劃線，用PBS洗2次，去除劃下來的細胞，然后加入5μmol/L SAHA繼續(xù)培養(yǎng)，36h后顯微鏡下觀察并拍照．用 Image J軟件測量劃痕寬度，按照式(1)計算細胞遷移率．

1.2.7 Transwell細胞遷移實驗

計數(shù) 5×105個 HeLa細胞，用含有 SAHA的無血清培養(yǎng)基懸浮并加入到 Transwell上室中，下室加入含有 10%血清的培養(yǎng)液，培養(yǎng) 10h．取上層小室，用棉簽擦去濾膜正面的細胞，再用含 4%多聚甲醛溶液固定濾膜底面的細胞，DAPI溶液染核，通過激光掃描共聚焦顯微鏡對至少 5個視野照相．相對細胞遷移率按照式(2)計算．

1.2.8 TUNEL法檢測細胞凋亡

加藥處理 HeLa細胞，DMSO作為陰性對照組．24h后，按照Fluorometric TUNEL System試劑盒的步驟處理細胞，熒光顯微鏡下觀察并拍照．

1.3 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)使用 SPSS v13.0軟件處理，各組實驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”表示．組間統(tǒng)計學差異分析采用 t檢驗，*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01．

2 結果與分析

2.1 SAHA對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響

SAHA處理HeLa細胞24h后，顯微鏡下觀察細胞密度和形態(tài)學變化．十字孢堿(ST)可以誘導腫瘤細胞凋亡，用作陽性對照．結果顯示，與未加藥組或DSMO組相比，SAHA組細胞密度小，細胞面積變大，細胞偽足變尖(圖 1)．而十字孢堿處理組細胞密度也減小，但細胞體積變小、形態(tài)變圓，與 SAHA 處理的細胞明顯不同．

圖1 加藥處理后HeLa細胞的形態(tài)學變化Fig. 1 Morphological changes of HeLa cells after SAHA or ST treatment

為了定量分析 SAHA對宮頸癌細胞的作用，利用臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù)，結果如圖 2所示．SAHA抑制 HeLa細胞的增殖，并且隨著 SAHA濃度的加大，活細胞數(shù)目逐漸減少；當SAHA濃度為5μmol/L時，活細胞數(shù)目約為空白對照組的50%．以上結果表明：SAHA抑制宮頸癌HeLa細胞增殖．

圖2 臺盼藍染色法計數(shù) SAHA處理后 HeLa活細胞的數(shù)量Fig. 2 Quantification of viable HeLa cells after SAHA treatment

2.2 SAHA對p21基因表達的影響

真核細胞的增殖周期受到多種因素調控．p21蛋白對細胞增殖周期起負調控作用，引起細胞周期阻滯．為了探究 SAHA抑制細胞增殖與 p21基因表達的關系，用不同濃度 SAHA處理 HeLa細胞 24h，然后提取 RNA，利用 RT-PCR和 Real-time PCR檢測p21的mRNA水平，結果如圖3所示．

圖3 SAHA上調p21基因表達Fig. 3 Expression of p21 increased after SAHA treatment

p21mRNA水平隨 SAHA濃度升高逐漸上調，與常規(guī) PCR結果一致．Real-time PCR結果顯示：SAHA處理后p21mRNA水平升高約16倍．用不同濃度SAHA處理HeLa細胞48h后裂解細胞提取總蛋白，Western blot檢測p21蛋白水平結果顯示：p21蛋白隨著SAHA濃度的增加而增加．可見，SAHA引起 HeLa細胞中 p21基因表達的上調，從而阻滯了HeLa細胞周期，最終抑制HeLa細胞增殖．

2.3 SAHA對宮頸癌HeLa細胞凋亡的影響

本實驗利用TUNEL法檢測SAHA處理的HeLa細胞是否會發(fā)生凋亡，十字孢堿(ST)處理組為陽性對照組，DMSO組為陰性對照組，結果如圖 4所示．加藥處理 24h后，ST處理組細胞核內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，表明ST誘導Hela細胞發(fā)生凋亡；而SAHA處理組與 DMSO對照組 TUNEL染色均為陰性，說明無細胞凋亡現(xiàn)象．以上結果表明：SAHA并不會引起HeLa細胞凋亡．

圖4 TUNEL法檢測SAHA處理對HeLa細胞凋亡的影響Fig. 4 TUNEL assay determining the apoptosis of HeLa cells following SAHA treatment

2.4 SAHA誘導HeLa細胞衰老

細胞衰老受到p53-p21信號通路的調節(jié)[15]．圖1顯示SAHA處理后HeLa細胞貼壁良好，體積變大，形態(tài)改變，符合細胞衰老的特點．圖3顯示SAHA上調 p21基因表達．這些實驗結果提示 SAHA可能誘導細胞衰老．

檢測細胞衰老的主要方法是 β-半乳糖苷酶染色法．衰老相關 β-半乳糖苷酶在 pH 6.0左右有活性，催化 X-Gal發(fā)生顏色反應，使衰老細胞藍染．用5μmol/L SAHA處理HeLa細胞72h，結果如圖5所示．SAHA組多數(shù)細胞內(nèi)生成的藍色產(chǎn)物證明細胞內(nèi)衰老相關 β-半乳糖苷酶活性提高，而 DMSO組多數(shù)細胞內(nèi)沒有藍染，僅個別細胞內(nèi)和細胞間隙出現(xiàn)藍色，藍染的細胞數(shù)量和染色程度遠低于 SAHA處理組．此結果證明SAHA誘導HeLa細胞發(fā)生衰老．

圖5 衰老相關β-半乳糖苷酶染色法檢測細胞衰老Fig. 5 Examination of cell senescence with β-galactosidase staining method

2.5 SAHA抑制HeLa細胞遷移能力

惡性腫瘤細胞遷移能力增強會導致腫瘤轉移.為觀察 5μmol/L SAHA對 HeLa細胞遷移能力的影響進行劃痕實驗，結果如圖6所示．

圖6 劃痕實驗檢測SAHA對HeLa細胞遷移能力的影響Fig. 6 Measuring the effect of SAHA on the migration of HeLa cells with scratch wound-healing assay

36h時對照組細胞的劃痕幾近愈合；而此時SAHA組細胞劃痕明顯沒有愈合．Image J軟件定量分析，SAHA組細胞劃痕愈合能力明顯減弱，細胞遷移率下降了 40%左右，說明 SAHA能夠抑制 HeLa細胞的遷移能力．

劃痕實驗結果表明 SAHA抑制 HeLa細胞的水平方向遷移，為探究 SAHA是否也可以影響細胞空間遷移能力，采用 transwell實驗進行驗證，結果如圖7所示．由圖7(a)可見，與DMSO組相比，加藥組的細胞穿過小室濾膜從濾膜正面遷移到底面的數(shù)量明顯減少．圖7(b)結果顯示，SAHA處理后細胞遷移率下降 70%，與劃痕實驗結果一致．綜合細胞劃痕和transwell實驗結果表明，SAHA抑制HeLa細胞的遷移能力．

圖7 Transwell法檢測 SAHA對 HeLa細胞遷移能力的影響Fig. 7 Effects of SAHA on the migration of HeLa cells determined with Transwell assay

2.6 SAHA對遷移相關基因表達的影響

MYL9即肌球蛋白輕鏈 9，是細胞骨架結構的重要組分，參與細胞的運動與形態(tài)變化，影響細胞遷移能力．為了揭示SAHA抑制HeLa細胞遷移的機制，本實驗使用不同濃度 SAHA處理細胞，利用 RTPCR、Real-time PCR和 Western blot的方法檢測了MYL9在RNA水平與蛋白水平的表達情況，結果如圖8所示．由圖8可知：SAHA下調MYL9mRNA水平且呈現(xiàn)濃度依賴性；Real-time PCR結果與RT-PCR結果一致，5μmol/L SAHA 處理后 HeLa細胞中MYL9mRNA水平下降約60%；Western blot結果顯示，MYL9蛋白水平隨 SAHA濃度增加而逐漸下降．以上實驗結果證明，SAHA抑制遷移相關基因MYL9的表達．

圖8 SAHA抑制遷移相關基因MYL9表達Fig. 8 Expression of the migration-related MYL9 gene decreased after SAHA treatment

3 討 論

為了探究以SAHA為代表的HDAC抑制劑的抗宮頸癌作用，本課題通過細胞和分子水平的實驗證明SAHA抑制宮頸癌HeLa增殖而不引起細胞凋亡；同時，SAHA上調衰老相關β-半乳糖苷酶活性，誘導細胞衰老；下調遷移相關基因MYL9表達，降低細胞遷移能力．已往研究多數(shù)關注 SAHA對細胞增殖和凋亡的影響，SAHA與其他放療、化療聯(lián)合應用時抑制細胞增殖、促進細胞凋亡．而本文發(fā)現(xiàn)SAHA本身并不促進 HeLa細胞凋亡，而是誘導 HeLa細胞衰老和抑制HeLa細胞遷移．宮頸癌等惡性腫瘤導致病人死亡的主要原因是腫瘤細胞從原發(fā)灶轉移至肺、腦等重要臟器破壞其功能．SAHA降低宮頸癌HeLa細胞遷移能力，提示 SAHA可能降低宮頸癌細胞轉移的機率，是潛在的抗宮頸癌藥物．

細胞衰老指細胞增殖和分化能力及生理功能發(fā)生衰退，可發(fā)生于非腫瘤細胞，也可以發(fā)生于腫瘤細胞．當正常細胞受到損傷時，細胞衰老可以防止損傷細胞增殖和癌變．惡性腫瘤細胞增殖能力顯著強于正常細胞，一般不發(fā)生衰老．應用放化療方法治療腫瘤時，大量的損傷可誘導腫瘤細胞發(fā)生衰老[16]．這種治療相關的腫瘤細胞衰老一方面可以抑制腫瘤細胞增殖，達到抗癌效果；另一方面，衰老的細胞保持了產(chǎn)生細胞因子的能力，可能因此改變腫瘤微環(huán)境，促進免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞．另外，也有研究認為這種衰老卻不死亡的腫瘤細胞在治療結束后可能成為腫瘤復發(fā)的原因[16-18]．腫瘤治療相關的細胞衰老對療效的影響目前還不確定，本研究發(fā)現(xiàn) SAHA單獨使用誘發(fā)細胞衰老而不是凋亡，所以，在應用SAHA治療宮頸癌時應考慮其誘導細胞衰老現(xiàn)象，制定合理治療方案．

目前發(fā)現(xiàn)的HPV病毒有100多種亞型，根據(jù)是否致癌，可分為低危型和高危型HPV．導致宮頸癌的高危型HPV亞型包括16型、18型、52型等，其中16型和18型HPV在宮頸癌組織的陽性率超70%[19-20]，因此宮頸癌研究多以攜帶16型或18型HPV的細胞系為模式細胞，本研究選擇的是攜帶HPV18的HeLa細胞系．為了驗證 SAHA對宮頸癌的抑制作用是否也適用于攜帶其他 HPV亞型的癌細胞，下一步工作將對攜帶 HPV16的 CaSki、SiHa等宮頸癌細胞系進行檢測，并計劃在動物水平檢測 SAHA的抗宮頸癌作用．通過分子、細胞和動物水平的研究，為研發(fā)具有抗宮頸癌作用的SAHA及其衍生物奠定理論基礎.