李艷茹，張騰勛，郭聰聰，張同存，齊 威，王 楠

(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)和世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)對(duì)益生菌定義為一種活的微生物，在給予足夠劑量時(shí)對(duì)宿主的健康起有益作用[1].益生菌仍然以乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)為主.乳酸菌是指能發(fā)酵糖，主要產(chǎn)生乳酸的一類細(xì)菌的總稱．益生菌作為對(duì)機(jī)體有益的微生物，在預(yù)防和治療多種腸道疾病方面廣泛應(yīng)用[2]，包括腹瀉、腸易激綜合征、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、麩質(zhì)不耐癥、胃腸炎和復(fù)發(fā)的慢性腸炎等[3-5]．隨著越來(lái)越多的證據(jù)表明益生菌對(duì)機(jī)體具有有益作用，益生菌菌株已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種食品中，如酸奶、泡菜、米酒及嬰幼兒益生菌產(chǎn)品．

嬰幼兒時(shí)期是機(jī)體各項(xiàng)功能形成和完善的時(shí)期，也是腸道微生態(tài)形成的重要階段．來(lái)自無(wú)菌動(dòng)物的研究表明，體內(nèi)定植的微生物對(duì)動(dòng)物早期腸道形態(tài)發(fā)育、腸上皮細(xì)胞增殖、免疫系統(tǒng)分化等腸道發(fā)育過(guò)程有重要影響[6-7]．通過(guò)微生物干預(yù)，尤其是益生菌干預(yù)，有效地增強(qiáng)腸道的消化吸收能力，促進(jìn)黏膜屏障、免疫快速成熟，進(jìn)而提高機(jī)體防疫能力，對(duì)于嬰幼兒的健康發(fā)育具有重要意義．因此，本研究旨在從新生兒糞便中分離篩選安全、有效的益生菌，為開(kāi)發(fā)對(duì)腸道炎癥疾病具有預(yù)防和治療作用的新菌株提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

腸黏液層是抵御腸內(nèi)致病菌及有害物質(zhì)入侵的第一道屏障，黏蛋白 2(mucin2，MUC2)是構(gòu)成腸黏液層的最重要蛋白質(zhì)，其數(shù)量及結(jié)構(gòu)的改變與腸黏膜屏障損傷發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)．腸上皮細(xì)胞緊密連接(tight junction，TJ)是腸黏膜屏障的重要組成部分，一旦 TJ受損，腸上皮細(xì)胞間的通透性增加，細(xì)菌內(nèi)毒素和大分子物質(zhì)就可通過(guò)緊密連接進(jìn)入體循環(huán)，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)．閉鎖蛋白(occludin，OCLN)、封閉蛋白 1(claudin1，CLDN1)、閉鎖小帶蛋白 1(zonula occluden-1，ZO-1)是緊密連接中重要的3個(gè)蛋白[8]．因此研究從健康嬰兒糞便中分離的LAB對(duì)此4種蛋白表達(dá)的影響，可反映該菌對(duì)促進(jìn)腸道黏膜屏障完整性的作用及作用機(jī)制．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品、細(xì)胞和菌株

出生一個(gè)月內(nèi)嬰兒的糞便樣品由自天津藍(lán)海蘭母嬰家政服務(wù)有限公司開(kāi)發(fā)區(qū)分公司提供．SW620細(xì)胞，徐州醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)．HT-29細(xì)胞，天津科技大學(xué)滕玉鷗老師惠贈(zèng)．COS-7細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)．藤黃微球菌(Micrococcus luteus)ATCC49732、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923、單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)CMCC54002、大腸桿菌(Escherichia coli)CMCC44102為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種．pMUC2-lucpGL3質(zhì)粒本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建．

1.1.2 試劑與儀器

MRS肉湯，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；鹽酸，天津市江天化工技術(shù)有限公司；牛膽鹽，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司．DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基，Gibco公司；胎牛血清(FCS)，杭州四季青生物工程公司；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、Trizol試劑，北京索萊寶科技有限公司；SYBR Green qPCR Mastermix，DBI Bioscience公司；dNTPs，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Luciferase Assay System(E1501)，Promega 公司；claudin1(YT0942)一抗、ocludin(YN2865)一抗、zo-1(YN1410)一抗、MUC2 ELISA 檢測(cè)試劑盒，ImmunoWay公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗，Santa Cruz公司；IRDye-800標(biāo)記山羊抗小鼠二抗、IRDye-800標(biāo)記山羊抗兔二抗，美國(guó) Li-COR公司；TurboFect轉(zhuǎn)染試劑，Thermo公司．

多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo有限公司；轉(zhuǎn)膜儀，Bio-Rad公司；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，美國(guó)LI-COR公司；stepone plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國(guó)ABI公司．DG 250厭氧培養(yǎng)箱，英國(guó)Don Whitley Scientifi(DWS)公司；pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器上海公司；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠．

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離、篩選

使用平板劃線法對(duì)菌落進(jìn)行純化．將糞便樣品梯度稀釋到10-6涂布到添加碳酸鈣的固體MRS培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)48h，挑選產(chǎn)生溶鈣圈的菌落反復(fù)在 MRS培養(yǎng)基上劃線，仔細(xì)鑒別不同菌落的形態(tài)特點(diǎn)并進(jìn)行革蘭氏染色．同時(shí)，將菌株用甘油管于－80℃凍存．提取基因組，對(duì)其進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送往金唯智生物科技有限公司測(cè)序，然后采用BLAST對(duì)結(jié)果進(jìn)行16S rDNA比對(duì)．

耐酸能力測(cè)定：菌株于 MRS液體培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)過(guò) 3次活化，每次培養(yǎng)12h，對(duì)活化后得到的菌液離心收集菌體分別重懸于pH 為 2.0、3.0、4.0的液體 MRS培養(yǎng)基中[9]，調(diào)整菌體密度為5×108mL-1．取100μL菌液于96孔板中，每個(gè)樣液做 3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)以常規(guī) pH MRS培養(yǎng)基組作為陰性對(duì)照．置于 37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h．利用 MTT法，在 490nm 處測(cè)定吸光度(A)，按照式(1)計(jì)算存活率[10-11]．

耐膽鹽能力測(cè)定：菌株于 MRS液體培養(yǎng)基中37℃厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經(jīng)過(guò) 3次活化，每次培養(yǎng)12h，對(duì)活化后得到的菌液離心收集菌體重懸于含0.1%～0.3%膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中[12]，調(diào)整菌體密度為5×108mL-1．置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h．按照1.2.2節(jié)的方法測(cè)定存活率[13]．

1.2.2 菌株活化、樣品制備及細(xì)胞培養(yǎng)

將保存在－80℃菌種常溫下解凍，于 2%接種于MRS液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)2次活化，每次培養(yǎng)12h，最終接菌于 100mL培養(yǎng)基中，同時(shí)以 100mL空白培養(yǎng)基為對(duì)照組，12h后離心，取上清液，50℃旋蒸1.5h左右，倒入玻璃培養(yǎng)皿中，放入-80℃冰箱24h，于凍干機(jī)中凍干處理．凍干樣品重懸于細(xì)胞培養(yǎng)基中．

HT-29、COS-7細(xì)胞用含 10% FCS 的 F12培養(yǎng)基(含 1×105U/L青霉素和 100mg/L鏈霉素)，SW620用含10% FCS 的RPMI 1640培養(yǎng)基(含1×105U/L青霉素和 100mg/L鏈霉素)，在 37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，24h后換液，以后每 2、3d更換1次培養(yǎng)液．細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用2.5g/L胰酶消化后傳代．

1.2.3 結(jié)腸細(xì)胞黏附能力測(cè)定

SW620細(xì)胞以 104mL-1的密度均勻鋪種在 96孔板中培養(yǎng) 2d，將已長(zhǎng)至單層的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620用滅菌的 PBS(pH 7.4)漂洗 2次，將 100μL乳酸菌(5×108mL-1)加入96孔細(xì)胞板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1h后，用滅菌的PBS漂洗3次，以洗去未黏附的菌．應(yīng)用MTT法分別測(cè)定PBS漂洗后的益生菌(A黏附菌)、未漂洗的益生菌(A總菌)及未加菌空白對(duì)照(A對(duì)照)孔的吸光度，按照式(2)計(jì)算黏附率．

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實(shí)驗(yàn)

HT-29細(xì)胞以 104mL-1的密度均勻鋪種在 6孔板中培養(yǎng) 2d，經(jīng)加入 5mg/mL 凍干的發(fā)酵液的上清液處理24h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中 MUC2水平，試劑盒采用人 MUC2ELISA檢測(cè)試劑盒．檢測(cè)方法按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行．

1.2.5 熒光素酶活性檢測(cè)

以 104mL-1密度均勻鋪種 COS-7 細(xì)胞于 24孔板中，鋪種24h后用TurboFect轉(zhuǎn)染試劑對(duì)pMUC2-luc質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6h后換液，并將已處理的樣品以5mg/mL的濃度加入已轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的24孔板培養(yǎng)基中．繼續(xù)培養(yǎng)24h后，棄去上清液，在24孔板每孔加入100μL的裂解液，裂解30min，再用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，將裂解的蛋白50μL加入白色96孔板中，同時(shí)加入熒光素酶化學(xué)發(fā)光底物 100μL，迅速放入酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)其熒光值．

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)

HT-29細(xì)胞以 104mL-1的密度均勻鋪種在 6孔板中培養(yǎng) 2d，經(jīng)加入 5mg/mL 樣品處理 24h后，Trizol法提取HT-29細(xì)胞中RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄 2μg樣品．Real-time PCR法檢測(cè) MUC2、OCLN、CLDN1、ZO-1基因的表達(dá)．PCR 體系：10μL DDW，7.6μL Mix，0.4μL Rox，0.5μL 上游引物，0.5μL下游引物，1μL cDNA模板．PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 2min，95℃變性 10s，60℃退火和延伸30s，共 40個(gè)循環(huán)，95℃終止反應(yīng) 15s．所用引物見(jiàn)表 1．

表1 引物Tab. 1 Primers

1.2.7 免疫印跡(Western blot)

HT-29細(xì)胞以 104mL-1的密度均勻鋪種在 6孔板中培養(yǎng) 2d，經(jīng)加入 5mg/mL樣品處理 24h后，收集總蛋白．蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，浸入封閉液中封閉1h．分別加稀釋后的 ZO-1一抗(1﹕1000)、CLDN1一抗(1﹕1000)、OCLN 一抗(1﹕1000)和 GAPDH一抗(1﹕3000)，4 ℃孵育過(guò)夜，山羊抗兔(1﹕10000)或山羊抗鼠(1﹕10000)二抗室溫下避光孵育1.5h，將 NC膜平鋪于遠(yuǎn)紅外成像儀中，設(shè)置程序掃膜，保存數(shù)據(jù)．

1.2.8 抑菌能力檢測(cè)

取 106mL-1的 M.luteus、L.monocytogenes、S.aureus、E.coli菌懸液 50μL作為指示菌(菌體濃度為 108mL-1)，涂布于已凝固的瓊脂平板上，平衡30min．無(wú)菌操作：將 3只無(wú)菌牛津杯(直徑 8cm)輕輕放在平板上，杯內(nèi)分別加入106mL-1的RZ18菌懸液、MRS培養(yǎng)基 30μL．平放 37℃孵箱培養(yǎng) 16～18h，觀察抑菌圈的大小，抑菌圈直徑＞8mm，則判斷為敏感菌株，表明有抑菌效果[14]．

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)由 Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，*、**分別表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＜0.05、P＜0.01．

2 結(jié)果與分析

2.1 LAB耐酸能力

對(duì)從新生兒糞便中分出的15株LAB的耐酸、耐膽鹽及細(xì)胞黏附進(jìn)行初步檢測(cè)，篩選出5株相對(duì)抗逆性較好的 LAB，分別是糞腸球菌(Enterococcus faecalis)RZ18和 RZ002、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)RZ003和RZ004、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)RZ005．人體胃液pH通常為2.0左右，隨進(jìn)食時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸上升至pH 5.0左右，胃排空時(shí)間一般為 3～4h．要成為食源性的益生菌，應(yīng)該具有一定的耐酸性．對(duì) 5株菌的耐酸能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖 1所示．

圖1 5株乳酸菌耐酸能力分析Fig. 1 Acid resistance analysis of the five LAB strains

在pH 2時(shí)，L.casei RZ003和RZ004存活率均較低，分別為(12.41±0.13)%和(11.27±0.12)%，其他3種菌 E.faecalis RZ18、RZ002以及 P.acidilactici RZ005存活率在 20%左右．在 pH 3時(shí)，L.casei RZ003存活率最低，僅為(13.69±0.24)%，其他 4種菌 E.faecalis RZ18、RZ002 和 L.casei RZ004、P.acidilactici RZ005存活率在20%左右．在pH 4時(shí)，L.casei RZ004存活率最高，可達(dá)(72.64±0.11)%，其他4種菌E.faecalis RZ18、RZ002和L.casei RZ003、P.acidilactici RZ005存活率均在40%～50%．

2.2 LAB耐膽鹽能力

人體腸道內(nèi)膽汁濃度是變化的，膽鹽含量總體在0.03%～0.3%的范圍內(nèi)波動(dòng)．本研究中研究了 5株LAB對(duì) 0.1%、0.2%、0.3%膽鹽的耐受能力進(jìn)行分析．結(jié)果如圖 2所示，在含有 0.1% 膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4h后，E.faecalis RZ18和 RZ002、P.acidilactici RZ005存活率在 100%以上，說(shuō)明在 0.1%的膽鹽環(huán)境中并不會(huì)影響這 3株菌的生長(zhǎng)．在含有 0.2%膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h后，P.acidilactici RZ005存活率最高，可達(dá)(57.2±1.57)%，其他 4株菌均在 25%～35%. 在含有0.3%膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h后，各菌存活率相差不大，均在20%～35%．

圖2 5株乳酸菌耐膽鹽能力分析Fig. 2 Analysis of bile salt tolerance of the 5 LAB strains

2.3 LAB黏附能力

LAB在腸道的黏附定植部位主要發(fā)生在結(jié)腸，因此本研究采用人結(jié)腸癌細(xì)胞 SW620模擬腸道環(huán)境，通過(guò) MTT法測(cè)定不同 LAB對(duì)結(jié)腸細(xì)胞黏附能力的差異．結(jié)果如圖3所示，E.faecalis RZ18、RZ002和 P.acidilactici RZ005的黏附能力較強(qiáng)，其中P.acidilactici RZ005最強(qiáng)為(51.96±9.06)%．

圖3 5株乳酸菌對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附能力分析Fig. 3 Adhesion analysis of the five LAB strains to human colon cancer cells

2.4 LAB發(fā)酵上清液對(duì) HT-29細(xì)胞中 MUC2蛋白表達(dá)的上調(diào)作用

黏蛋白(MUC)是由體內(nèi)多種上皮細(xì)胞分泌的大分子糖蛋白，包括 MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6-7、MUC1、MUC3-4、MUC13 和 MUC17 等多個(gè)亞型．MUC2屬于分泌型黏蛋白，在腸道的表面形成黏液層發(fā)揮潤(rùn)滑和拮抗致病菌的腸道黏附和侵襲的作用，是黏液屏障中重要蛋白之一．MUC2表達(dá)量的上調(diào)表明其黏液屏障更加完善．5mg/mL發(fā)酵上清液處理HT-29細(xì)胞24h后，利用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中 MUC2的含量，結(jié)果如圖 4所示，E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液可使MUC2蛋白的表達(dá)量上調(diào)，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05)．

圖4 5株乳酸菌發(fā)酵上清液對(duì)MUC2蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of fermentation supernatant from the five LAB strains on MUC2 protein expression

2.5 E. faecalis RZ18發(fā)酵上清液增強(qiáng) MUC2啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄水平

利用 E.faecalis RZ18菌株發(fā)酵上清液處理COS-7細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染 pMUC2-luc質(zhì)粒，采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法檢測(cè) MUC2啟動(dòng)子活性，結(jié)果如圖5所示，E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液可顯著上調(diào)MUC2的啟動(dòng)子活性(*P＜0.05)．

圖5 E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液對(duì) MUC2啟動(dòng)子活性的影響Fig. 5 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the promoter activity of MUC2

用E.faecalis RZ18菌株發(fā)酵上清液處理HT-29細(xì)胞 24h后，Real-time PCR方法檢測(cè) MUC2的mRNA水平，結(jié)果(圖6)發(fā)現(xiàn) E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液能顯著上調(diào)MUC2mRNA的水平(*P＜0.05).這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)E.faecalis RZ18的發(fā)酵上清液可以促進(jìn)MUC2的轉(zhuǎn)錄水平升高．

圖6 E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液對(duì) MUC2 mRNA水平的影響Fig. 6 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the mRNA level of MUC2

2.6 E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液上調(diào) OCLN、CLDN1、ZO-1蛋白的表達(dá)水平

腸黏膜通透性的變化與腸黏膜緊密連接蛋白的一系列改變有關(guān)，提高腸道ZO-1和OCLN mRNA及其蛋白水平的表達(dá)，可增強(qiáng)其腸道屏障功能[15]，CLDN1表達(dá)水平下調(diào)可以作為評(píng)價(jià)腸道黏膜屏障功能是否發(fā)生障礙的重要指標(biāo)[16]．利用RZ18菌株發(fā)酵上清液處理HT-29細(xì)胞24h后，利用Real-time PCR和WB方法檢測(cè)OCLN、CLDN1、ZO-1的mRNA和蛋白水平，結(jié)果如圖7和圖8所示．

圖7 E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液對(duì) CLDN1、OCLN、ZO-1 mRNA水平的影響Fig. 7 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the mRNA level of CLDN1，OCLN and ZO-1

圖8 E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液對(duì) CLDN1、OCLN、ZO-1蛋白水平的影響Fig. 8 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the protein level of CLDN1，OCLN and ZO-1

結(jié)果表明，E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液可顯著上調(diào)緊密連接蛋白CLDN1、OCLN、ZO-1的mRNA水平，與對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P＜0.05，**P＜0.01)．同時(shí)，E.faecalis RZ18發(fā)酵上清液可顯著上調(diào)緊密連接蛋白 CLDN1和 OCLN的蛋白水平(*P＜0.05)，也可增加 ZO-1的蛋白水平，但與對(duì)照組相比差異不顯著．

2.7 E.faecalis RZ18對(duì)M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes、E.coli的抑制作用

利用牛津杯法檢測(cè)RZ18對(duì)M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes、E.coli等 4種致病菌的抑制作用，結(jié)果表明：RZ18對(duì) S.aureus、M.luteus、L.monocytogenes、E.coli有不同程度的抑制作用，其中對(duì)M.luteus、E.coli抑制效果較差，抑菌圈直徑僅為(17±0.30)mm、(17±0.25)mm；對(duì) L.monocytogenes抑菌圈直徑為(18±0.23)mm；對(duì) S.aureus抑制效果最明顯，抑菌圈直徑達(dá)(21±0.16)mm．M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes是革蘭氏陽(yáng)性菌，E.coli為革蘭氏陰性菌，因此，E.faecalis RZ18對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌均有一定抑制作用．

3 討 論

益生菌可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群、增強(qiáng)機(jī)械屏障、調(diào)節(jié)腸黏膜免疫功能，從而在生物屏障、機(jī)械屏障、免疫屏障 3個(gè)層次增強(qiáng)腸黏膜屏障．?huà)雰簳r(shí)期是腸道菌群建立的關(guān)鍵時(shí)期，若此時(shí)腸道菌群構(gòu)造合理、代謝平衡，那么今后機(jī)體腸道屏障發(fā)育將更加完善，進(jìn)而為機(jī)體減少各種代謝類疾病風(fēng)險(xiǎn)[17-19]．動(dòng)物研究表明，鼠李糖乳桿菌GG能夠增強(qiáng)新生小鼠腸上皮細(xì)胞的增殖、遷移、分化、屏障功能的形成[20]．李碧瑩[21]發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)嬰幼兒口服益生菌，能有效調(diào)節(jié)胃腸道細(xì)菌的生長(zhǎng)及繁殖，改善胃腸菌群失衡狀況，同時(shí)能夠維持腸細(xì)胞的完整性，修復(fù)因感染輪狀病毒所致腸黏膜損傷，加速恢復(fù)胃腸黏膜屏障正常功能，從而提高對(duì)嬰幼兒輪狀病毒性腹瀉的臨床療效．由于嬰幼兒腸道屏障發(fā)育與體內(nèi)定植益生菌關(guān)系密切，因此本研究選用新生兒糞便作為菌種來(lái)源，希望可以獲得更安全、能在機(jī)體定植、具有促進(jìn)腸道屏障發(fā)育和完整性的新型益生菌．本研究從新生兒糞便中分離出一株具有促進(jìn)腸道黏液 MUC2表達(dá)的菌株E.faecalis RZ18．

Claudin1是緊密連接跨膜蛋白，對(duì)維持腸上皮細(xì)胞屏障功能和緊密連接的完整性具有重要作用，細(xì)胞旁 Claudin蛋白作為細(xì)胞間緊密聯(lián)接通道，具有電通道的作用．跨膜蛋白 Occludin可增強(qiáng)成纖維細(xì)胞間的黏附性，增加跨膜電阻[22]，調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通透性[23].研究[24]表明，腸致病菌及其毒素通過(guò)下調(diào) Occludin蛋白表達(dá)的途徑破壞TJ結(jié)構(gòu)．ZO-1是構(gòu)成緊密連接的重要成分之一，能與其同源體 ZO-2、ZO-3一起為緊密連接的許多跨膜蛋白和細(xì)胞質(zhì)緊密連接蛋白搭建具有連接作用的腳手架樣平臺(tái)．多數(shù)情況下只要ZO-1受到破壞，緊密連接的功能大多會(huì)隨之發(fā)生變化，而 ZO-1蛋白增加，提示其能增強(qiáng)上皮組織的緊密連接以及結(jié)構(gòu)的完整性，使腸道上皮細(xì)胞組織的選擇性通透性增強(qiáng)，因此 ZO-1常被用來(lái)作為觀察機(jī)體內(nèi)各種組織的緊密連接屏障功能和通透性功能的指標(biāo)．本研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌 RZ18能上調(diào) Claudin1、Occludin、ZO-1的水平，說(shuō)明嬰幼兒體內(nèi)早期定植的糞腸球菌可能對(duì)于腸道屏障的完整性具有一定的促進(jìn)作用．

長(zhǎng)期的科學(xué)研究表明，人類腸道中廣泛存在的乳酸菌在膳食應(yīng)用上具備良好的安全性[25]．臨床研究最多的乳酸菌是雙歧桿菌和乳酸桿菌，糞腸球菌和某些非致病性芽胞桿菌及兼性厭氧地衣芽胞桿菌也有所涉及．糞腸球菌被認(rèn)為是一種條件致病菌，在人的免疫力低下或大量使用抗生素時(shí)可導(dǎo)致尿路感染、心內(nèi)膜炎、腹膜炎、傷口感染等疾病[26]，但在一般情況下對(duì)人體和動(dòng)物是沒(méi)有危害的，屬于人和動(dòng)物體內(nèi)的常在菌，并能有效抑制有害菌，增殖有益菌，可作為益生菌制劑組方發(fā)揮藥理作用．目前對(duì)于糞腸球菌作為益生菌在人和動(dòng)物體內(nèi)的作用和應(yīng)用已有一些相關(guān)報(bào)道．Tinrat等[27]分離出一株具有較好的抑菌效果的糞腸球菌 MTC1032，該菌株通過(guò)產(chǎn)酸和細(xì)菌素有效抑制了多種病原菌，具有抑菌性，并能夠在酸性條件下生存．在安全性評(píng)價(jià)中，MTC1032能夠黏附于宿主上皮細(xì)胞，并能明顯抑制病原細(xì)菌黏附.Zheng等[28]研究采用含嬰兒雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、糞腸球菌和蠟樣芽胞桿菌的益生菌組合，通過(guò)高通量測(cè)序監(jiān)測(cè)血液指標(biāo)和微生物多樣性，減少胃切除術(shù)引起的生理障礙．他們認(rèn)為益生菌聯(lián)合用藥通過(guò)改變腸道菌群，顯著增強(qiáng)患者的免疫應(yīng)答，減輕炎癥的嚴(yán)重程度．薛勝平等[29]用酪酸菌、腸膜芽胞桿菌和糞腸球菌組方制備益生菌制劑，藥理作用是調(diào)節(jié)腸道菌群，增殖有益菌如雙歧桿菌、乳桿菌等，抑制有害菌，從而有整腸作用．甘利平等[30]在雞的飼糧中添加糞腸球菌雖對(duì)肉仔雞的生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著影響，但可改善腸道健康，尤其對(duì)早期雞只腸道的健康生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用．董正林[31]研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加微囊化糞腸球顯著提高了一定日齡肉雞平均體質(zhì)量，并顯著增加肉雞肝臟指數(shù)及肉雞血清 IgA、IgM 含量，且顯著增加肉雞盲腸乳酸桿菌數(shù)量和降低肉雞盲腸大腸桿菌數(shù)量．魏清甜[32]研究發(fā)現(xiàn)，添加 200g/t的糞腸球菌能夠顯著改善試驗(yàn)仔豬保育前期平均日增質(zhì)量、料重比、腹瀉率和保育后期的平均日采食量，能夠增強(qiáng)體液免疫性能，明顯提高保育仔豬對(duì)飼料中粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率，并對(duì)仔豬的腸道發(fā)育有一定的促進(jìn)作用，可降低空腸中 E.coli的數(shù)量，促進(jìn)仔豬盲腸微生態(tài)的平衡．

本研究從新生兒糞便中分離出一株糞腸球菌E.faecalis RZ18，其對(duì)多種致病菌有一定的抑制作用，并且對(duì)腸道黏膜屏障中重要的蛋白 MUC2、CLDN1、OCLN、ZO-1表達(dá)有上調(diào)作用，有望應(yīng)用于小兒或成人炎癥性腸病的預(yù)防與治療．同時(shí)，研究證實(shí)嬰幼兒體內(nèi)早期定植的糞腸球菌可能對(duì)嬰兒腸道黏膜屏障完整性的發(fā)育有促進(jìn)作用，這為開(kāi)發(fā)相應(yīng)益生菌制劑及功能食品提供了參考依據(jù)．