陳向陽，畢淑峰，李 艷，呂 奎，吳永祥

(1.黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山 245041； 2.黃山荷琇生物科技有限公司，安徽 黃山 245000；3.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

柳葉蠟梅(ChimonanthussalicifoliusHu)為我國特有蠟梅科蠟梅屬半常綠灌木，僅分布于安徽東南部、江西西北部、浙江中南部等山區(qū)[1]，具有藥用、飲用、食用等多種應(yīng)用價值，以柳葉蠟梅葉為材料制成的“脾胃舒膠囊”、香風(fēng)茶、食涼茶、黃金茶等已在市場銷售。柳葉蠟梅葉味微苦、辛、性涼，具有解表祛風(fēng)、清熱解毒等功能，臨床上可用于治療寒濕困脾、肝胃不和引起的腸胃不適、腹部脹痛、泄瀉等消化道疾病，也可用于預(yù)防感冒、流行性感冒、治療慢性氣管炎等，還能增強(qiáng)人體免疫力[2]。柳葉蠟梅葉香味濃郁，富含揮發(fā)性成分，以單萜、倍半萜及其含氧衍生物為主[3-4]，同時還含有生物堿[5]、黃酮[6-7]、香豆素[2，8]、萜類[9]等非揮發(fā)性成分。研究表明，柳葉蠟梅具有多種生物活性，柳葉蠟梅葉揮發(fā)油具有抗氧化活性[3，10]和抗腫瘤活性[11]，從柳葉蠟梅葉中分離得到的生物堿單體化合物對人結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW-1116、胃癌細(xì)胞株SGC-7901、人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-116均具有中等抑制活性[5]；不同極性柳葉蠟梅葉萃取物對綠膿桿菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌均有抑制作用，其中低極性的二氯甲烷萃取物的抑菌活性最強(qiáng)[12]。

柳葉蠟梅已被收入新食品原料名單，人們對這一新的食品資源愈加重視。目前，對柳葉蠟梅研究主要集中于人工種植和柳葉蠟梅葉的化學(xué)成分、生物活性等方面，而對其籽油的提取、成分等研究未見報道。本文采用超聲波輔助法提取柳葉蠟梅籽油，測定其理化性質(zhì)、維生素E含量和脂肪酸組成，并以ABTS自由基的清除作用和金屬離子的螯合作用為指標(biāo)評價其抗氧化活性，為柳葉蠟梅籽油的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

野生成熟柳葉蠟梅果實(shí)，采自安徽省黃山市休寧縣齊云山山區(qū)，經(jīng)去除果皮、曬干、剝?nèi)シN皮后得種仁，種仁粉碎后過20目篩，混勻后裝于棕色瓶中，儲存于4℃冰箱，備用。

菲洛嗪，東京化成工業(yè)株式會社；2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(ABTS)，瑞格生物科技有限公司；葡萄籽油，河南晶森油脂有限公司；石油醚(沸程30～60℃)、酚酞、甲醇、氯化鈉、氫氧化鉀、正己烷、無水硫酸鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

HP7890-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；SCQ-8201C型超聲波清洗儀，上海聲彥超聲儀器有限公司；UV756紫外可見分光光度計，上海元素儀器有限公司；N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化公司；DHG-905385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；AE224電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超聲波輔助法提取野生柳葉蠟梅籽油

稱取野生柳葉蠟梅種仁粉15.00 g，用脫脂濾紙包好，置于索氏提取器的圓底燒瓶中，向圓底燒瓶中加入320 mL石油醚，放入超聲波清洗儀中間斷超聲5次，每次超聲5 min，兩次超聲間隔10 min。超聲結(jié)束后將包有樣品的濾紙包放入索氏提取器的提取管中，在52℃水浴中加熱提取5.0 h，回收石油醚，得到淺黃色透明油狀液體，即為野生柳葉蠟梅籽油，共提取5批次。油存放于4℃冰箱，備用。

1.2.2 野生柳葉蠟梅籽油理化性質(zhì)和維生素E含量的測定

酸價，參照GB/T 5510—2011測定；水分及揮發(fā)物，參照GB/T 5528—2008測定；碘值，參照GB/T 5532—2008測定；過氧化值，參照GB 5009.227—2016測定；折光指數(shù)，參照GB/T 5527—2010測定；皂化值，參照GB/T 5534—2008測定；相對密度，參照GB/T 5526—1985測定；透明度，參照GB/T 5525—2008測定；維生素E，參照GB 5009.82—2016測定。

1.2.3 野生柳葉蠟梅籽油脂肪酸組成的測定

甲酯化：參考文獻(xiàn)[13]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。將50 μL野生柳葉蠟梅籽油置于20 mL帶蓋試管中，加4 mL正己烷與2 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，混勻，置于55℃恒溫水浴加熱30 min，加熱過程中，間斷取出振蕩混勻。加熱結(jié)束后，向試管中加入12 mL蒸餾水和2 mL飽和NaCl溶液，混勻，靜置，將上層有機(jī)相在8 000 r/min離心10 min，取上清液，加適量無水硫酸鈉干燥，過濾后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

氣相色譜條件：HP-5 MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；柱升溫程序為130℃保持5 min，以5℃/min升到285℃，保持5 min；載氣為高純氦氣(純度>99.99%)，流速為1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量0.5 μL。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV；溶劑延遲3.50 min；離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；全掃描采集方式；質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～550；質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST08。

1.2.4 野生柳葉蠟梅籽油抗氧化活性的測定

1.2.4.1 野生柳葉蠟梅籽油對ABTS自由基清除作用的測定

參考文獻(xiàn)[14]的方法，并適當(dāng)修改。將2.45 mmol/L過硫酸鉀與7 mmol/L ABTS自由基等量混合，混勻后靜置于暗處12 h。用甲醇稀釋ABTS自由基溶液，使稀釋液在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。取不同體積(10～50 μL)野生柳葉蠟梅籽油加入2 mL ABTS自由基溶液中，6 min后在734 nm處測吸光值(Ai)；將2 mL ABTS自由基溶液與不同體積(10～50 μL)的甲醇混合，6 min后在734 nm處測吸光值(A0)；將2 mL甲醇溶液與不同體積(10～50 μL)野生柳葉蠟梅籽油混合，6 min后在734 nm處測吸光值(Aj)。上述試驗中加入10～50 μL野生柳葉蠟梅籽油時，體積少于50 μL時，用甲醇補(bǔ)至50 μL。用葡萄籽油作為對照，重復(fù)上述試驗操作。計算ABTS自由基清除率，清除率=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100%。

1.2.4.2 野生柳葉蠟梅籽油對金屬離子螯合作用的測定

參考文獻(xiàn)[15]的方法，并適當(dāng)修改。取不同體積(10～50 μL)野生柳葉蠟梅籽油于5 mL試管中，加入2.8 mL蒸餾水、2 mmol/L的FeCl2·4H2O 50 μL和5 mmol/L的菲洛嗪150 μL，振蕩混勻，靜置10 min，在562 nm處測吸光值(At)，以相同體積甲醇代替野生柳葉蠟梅籽油作為空白對照，測其吸光值(A0)。上述試驗中加入10～50 μL野生柳葉蠟梅籽油時，體積少于50 μL時，用甲醇補(bǔ)至50 μL。用葡萄籽油作為對照，重復(fù)上述試驗操作。計算金屬離子螯合率，螯合率=(1-At/A0)×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 野生柳葉蠟梅籽油的理化性質(zhì)和維生素E含量

采用超聲波輔助法提取野生柳葉蠟梅籽油，得到的野生柳葉蠟梅籽油為淺黃色、澄清透明，有淡淡的油脂芳香味，得率為23.83%，低于湘西地區(qū)蠟梅籽油的含量[16]。野生柳葉蠟梅籽油理化性質(zhì)和維生素E含量見表1。

表1 野生柳葉蠟梅籽油的理化性質(zhì)和維生素E含量

由表1可見，野生柳葉蠟梅籽油的酸價(KOH)較低(2.28 mg/g)，符合食用植物油酸價的國家標(biāo)準(zhǔn)(≤4 mg/g)，說明野生柳葉蠟梅籽油中的游離脂肪酸含量較低，品質(zhì)較好。碘值是判斷油脂脂肪酸不飽和程度的重要指標(biāo)，碘值越大，不飽和脂肪酸含量越高。野生柳葉蠟梅籽油的碘值(I)為109.47 g/100 g，在100～130 g/100 g之間，說明野生柳葉蠟梅籽油為半干性油，其碘值高于湘西和上海采集蠟梅籽油的碘值[16-17]。過氧化值是衡量油脂氧化程度的指標(biāo)，數(shù)值越大，油脂氧化程度越高。野生柳葉蠟梅籽油的過氧化值為2.03 mmol/kg，符合食用植物油過氧化值的國家標(biāo)準(zhǔn)，表明試驗得到的野生柳葉蠟梅籽油氧化程度較低。油脂的皂化值與油脂中脂肪酸相對分子質(zhì)量有關(guān)，油脂的皂化值越大，油脂的脂肪酸相對分子質(zhì)量越小、碳鏈越短。野生柳葉蠟梅籽油皂化值(KOH)為185.81 mg/g，低于常見食用油皂化值(200 mg/g)[18]。此外，野生柳葉蠟梅籽油的水分及揮發(fā)物、相對密度、折光指數(shù)分別為0.82%、0.927 5和1.467 3。維生素E是一種廣泛存在于植物油中的脂溶性維生素。野生柳葉蠟梅籽油維生素E含量為109.27 mg/kg，低于核桃油、橄欖油、葵花籽油，高于花生油和棕櫚油[19]。

2.2 野生柳葉蠟梅籽油的脂肪酸組成

GC-MS分析結(jié)果表明，從野生柳葉蠟梅籽油中共分離出27種脂肪酸，鑒定出22種脂肪酸，占脂肪酸總量的99.65%，具體脂肪酸種類及相對含量見表2。

表2 野生柳葉蠟梅籽油的脂肪酸組成及相對含量 %

由表2可知，野生柳葉蠟梅籽油的脂肪酸種類較多，碳鏈長度為C14～C24，均為長鏈脂肪酸，包括7種C18脂肪酸(74.25%)、2種C16脂肪酸(20.40%)、3種C20脂肪酸(3.51%)、3種C22脂肪酸(0.90%)、2種C24脂肪酸(0.24%)、2種C19脂肪酸(0.05%)、1種C14脂肪酸(0.19%)、1種C17脂肪酸(0.07%)、1種C15脂肪酸(0.04%)。野生柳葉蠟梅籽油主要以C18和C16脂肪酸為主，兩者占脂肪酸總量的94.65%。C18脂肪酸以不飽和脂肪酸為主，含有6種不飽和脂肪酸，占脂肪酸總量的72.17%；C16以飽和脂肪酸為主，棕櫚酸占脂肪酸總量的20.26%。

野生柳葉蠟梅籽油包括8種飽和脂肪酸、9種單不飽和脂肪酸、5種多不飽和脂肪酸，分別占脂肪酸總量的24.28%、11.21%和64.16%，單不飽和脂肪酸含量最低，多不飽和脂肪酸含量最高，不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸含量分別為75.37%和24.28%，兩者的比值為3.10；不飽和脂肪酸以順式不飽和脂肪酸為主，反式雙鍵不飽和脂肪酸的含量只有0.05%。野生柳葉蠟梅籽油中含量較高的脂肪酸有亞油酸(55.60%)、棕櫚酸(20.26%)、油酸(8.08%)、10,13-十八碳二烯酸(8.02%)、花生烯酸(2.59%)和硬脂酸(2.08%)，這6種主要脂肪酸總含量為96.63%，含量最高的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別為棕櫚酸和亞油酸；其他16種脂肪酸含量較低，總含量只有3.02%。野生柳葉蠟梅籽油不飽和脂肪酸和油酸含量高于蠟梅籽油，蠟梅籽油中也鑒定出花生酸、花生烯酸、山崳酸、肉豆蔻酸，但未鑒定出13-二十二碳烯酸、11-二十二碳烯酸、15-二十四碳烯酸和木蠟酸[16-17]。

野生柳葉蠟梅籽油中亞油酸含量高達(dá)55.60%，與大豆油和玉米油中亞油酸含量相近[20]。亞油酸為必需脂肪酸，膽固醇必須與亞油酸結(jié)合后才能在體內(nèi)進(jìn)行正常的運(yùn)轉(zhuǎn)和代謝。因此，亞油酸具有預(yù)防動脈粥樣硬化和心腦血管疾病作用，有“血管清道夫”的美譽(yù)。亞油酸對小鼠的急性和慢性炎癥均有治療效果[21]，能調(diào)節(jié)脂肪代謝，具有減肥作用[22]。因此，野生柳葉蠟梅籽油在功能性食用油方面具有較好的開發(fā)價值。

2.3 野生柳葉蠟梅籽油的抗氧化活性

2.3.1 野生柳葉蠟梅籽油對ABTS自由基的清除作用

人體正常代謝會產(chǎn)生強(qiáng)氧化性的自由基，易對蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等產(chǎn)生傷害，從而引起機(jī)體的損傷[23]。野生柳葉蠟梅籽油的ABTS自由基清除作用見圖1。

圖1 野生柳葉蠟梅籽油對ABTS自由基的清除作用

由圖1可知，野生柳葉蠟梅籽油對ABTS自由基有很好的清除作用，且清除效果強(qiáng)于葡萄籽油，當(dāng)野生柳葉蠟梅籽油體積為50 μL時，清除率達(dá)到91.53%。在測試的體積范圍內(nèi)，野生柳葉蠟梅籽油對ABTS自由基的清除率與樣品量呈正相關(guān)，野生柳葉蠟梅籽油體積(X)與ABTS自由基清除率(Y)間的回歸方程為Y=1.730 7X+7.857 2(R2=0.989 7)，野生柳葉蠟梅籽油對ABTS自由基清除作用的ED50(清除率為50%時的樣品體積)為24.35 μL。

2.3.2 野生柳葉蠟梅籽油對金屬離子的螯合作用

金屬離子(如鐵、銅離子)被認(rèn)為是生物體中非正常性氧自由基產(chǎn)生的主要參與者，而且大多數(shù)生物分子與分子氧作用產(chǎn)生活性氧自由基的反應(yīng)速度在無金屬離子參與時是非常緩慢的，金屬離子可以催化此類反應(yīng)使其加快進(jìn)行[24]。野生柳葉蠟梅籽油對金屬離子的螯合作用見圖2。

圖2 野生柳葉蠟梅籽油對金屬離子的螯合作用

由圖2可知，野生柳葉蠟梅籽油對金屬離子有較好的螯合作用，當(dāng)野生柳葉蠟梅籽油體積為50 μL時，螯合率達(dá)到72.59%，但其螯合效果弱于葡萄籽油。在測試體積范圍內(nèi)，隨著樣品體積的增加，野生柳葉蠟梅籽油對金屬離子的螯合率逐漸增加，兩者存在量效關(guān)系，野生柳葉蠟梅籽油體積(X)與螯合率(Y)間的回歸方程為Y=1.334 6X+8.664 3(R2=0.985 0)，野生柳葉蠟梅籽油對金屬離子螯合作用的ED50(螯合率為50%時的樣品體積)為30.97 μL。

3 結(jié) 論

野生柳葉蠟梅籽油的酸價、過氧化值均符合食用植物油的國家標(biāo)準(zhǔn)，皂化值低于常見食用油皂化值，根據(jù)碘值判斷其為半干性油，可以作為開發(fā)食用油的潛在資源。從野生柳葉蠟梅籽油中共鑒定22種脂肪酸，包括8種飽和脂肪酸和14種不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸含量分別為75.37%和24.28%，兩者的比值為3.10，含量最高的飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸分別為棕櫚酸和亞油酸。野生柳葉蠟梅籽油對ABTS自由基的清除效果優(yōu)于葡萄籽油，對金屬離子的螯合作用弱于葡萄籽油，其ED50分別為24.35、30.97 μL，具有較好的抗氧化活性。