劉威良，吳白芬，黃艾祥

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201; 2.云南經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，昆明 650106)

辣木(Moringaoleifera)，為辣木科辣木屬的熱帶落葉木本蔬菜及油料作物，別名為鼓槌樹、洋椿樹等，原產(chǎn)于印度北部喜馬拉雅山南麓的速生樹種[1]。辣木渾身是寶，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、膳食纖維等，并具有克服失眠、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等功效，可作為優(yōu)質(zhì)的保健食品原料[2]。我國(guó)于20世紀(jì)60年代初將辣木引種云南，最初只注重其栽培育種，且種植規(guī)模較小，隨后意識(shí)到其重要的營(yíng)養(yǎng)及藥用價(jià)值，目前我國(guó)臺(tái)灣、廣東、廣西和福建等地也有廣泛種植并建有種植基地。2012年我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)辣木葉為新資源食品，2014年中國(guó)-古巴辣木科技合作中心在云南省熱帶作物科學(xué)研究所成立，標(biāo)志著辣木在我國(guó)的關(guān)注度日益增強(qiáng)。目前，辣木已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、飼料及凈水等領(lǐng)域，具有較大的商業(yè)和工業(yè)開發(fā)潛力。

辣木籽為辣木的種子，呈球形，直徑約1 cm，質(zhì)量約為0.3 g，富含油脂、蛋白質(zhì)及微量礦物元素等營(yíng)養(yǎng)成分，亦具有多種藥物活性如降血脂、降血糖、抗紫外線損傷等[3]。Abdulkarim等[4]研究指出，辣木籽含油率為31%，王有瓊等[5]亦報(bào)道辣木種子去皮后種仁含油率高達(dá)39%。辣木籽油室溫下呈淡黃色，具有無味、抗氧化性強(qiáng)、不易腐敗等優(yōu)良特性，其中脂肪酸的種類和組成與橄欖油類似，同時(shí)還含有生育酚、甾醇及維生素E等微量營(yíng)養(yǎng)成分，被認(rèn)為是食用橄欖油的理想代替品[6]。除作食用油外，辣木籽油還被廣泛應(yīng)用于化妝品、潤(rùn)滑油和生物柴油的制備。目前對(duì)辣木籽油的研究還停留在提取純化初級(jí)階段，對(duì)其活性的研究深度不夠，同時(shí)其對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要以辣木籽油為研究材料，結(jié)合藥理學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停醪娇疾炱鋵?duì)小鼠免疫活性的影響，進(jìn)而為其后期用于改善免疫功能的保健品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

新鮮辣木籽，購(gòu)于云南天佑科技開發(fā)有限公司，置于室外通風(fēng)處自然晾干。

醋酸潑尼松(批號(hào)：20180518)，浙江仙琚制藥股份有限公司；印度墨水(批號(hào)：20180512)，Solarbio生化試劑公司；羧甲基纖維素鈉；吐溫-80、無水乙醇、石油醚等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠，雄性，體重18～22 g，采購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證為SCXK(湘)2016-0002。

1.1.3 飼養(yǎng)環(huán)境

SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，云南省昆明市中國(guó)科學(xué)院昆明植物所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SYXK(滇)K2013-0004。

1.1.4 儀器與設(shè)備

Thermo1500全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司)，RE520旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Scientz-500C多功能恒溫超聲萃取儀，400Y多功能粉碎機(jī)，ZYJ-9018-2小型榨油機(jī)，CP153電子天平，TDL-5-A離心機(jī)，LC-162C海爾冰箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辣木籽油的制備

1.2.1.1 冷榨法

參考文獻(xiàn)[7]方法并改進(jìn)。取干燥辣木籽1 000 g，除雜去殼，設(shè)置榨油機(jī)參數(shù)為溫度6℃、壓力4 MPa、轉(zhuǎn)速36 r/min榨油，毛油靜置去除沉淀，得壓榨辣木籽油，稱重并分裝于無菌離心管中，凍存于-20℃冰箱備用。

1.2.1.2 超聲輔助溶劑萃取法

參考文獻(xiàn)[8]方法并改進(jìn)。取干燥辣木籽1 000 g，除雜去殼，粉碎，過80目篩，低溫避光保存。取一定量的辣木籽粉置于500 mL平底燒瓶中，采用超聲輔助溶劑萃取法，以沸程60～90℃的石油醚為溶劑，在料液比1∶10、萃取溫度75℃、萃取時(shí)間35 min、超聲頻率60 Hz下反復(fù)萃取4次，合并萃取液，旋蒸，得到萃取辣木籽油。

1.2.2 動(dòng)物分組及劑量

按人用藥量折算為小鼠灌胃劑量。小鼠購(gòu)買回來后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，將130只小鼠按體重隨機(jī)分為10組，確保組間體重?zé)o顯著性差異(P>0.05)，每組13只，即空白組(20 mL/kg)、模型組(醋酸潑尼松)(10 mg/kg)、壓榨辣木籽油高劑量組(2 g/kg)、壓榨辣木籽油低劑量組(1 g/kg)、萃取辣木籽油高劑量組(2 g/kg)、萃取辣木籽油低劑量組(1 g/kg)、壓榨辣木籽油(2 g/kg)+醋酸潑尼松(10 mg/kg)組、壓榨辣木籽油(1 g/kg)+醋酸潑尼松(10 mg/kg)組、萃取辣木籽油(2 g/kg)+醋酸潑尼松(10 mg/kg)組、萃取辣木籽油(1 g/kg)+醋酸潑尼松(10 mg/kg)組。各組均灌胃給藥，空白組給予同等劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液；聯(lián)合用藥組2種藥物給藥時(shí)間間隔至少為4 h。小鼠連續(xù)灌胃14 d期間不定期測(cè)定各組小鼠體重，并觀察各組小鼠精神狀態(tài)、皮毛色澤、飲食與糞便有無異常。14 d后測(cè)定小鼠的碳粒廓清指數(shù)、臟器指數(shù)及吞噬指數(shù)。

1.2.3 小鼠免疫抑制模型的建立

參考文獻(xiàn)[9]方法并改進(jìn)。采用醋酸潑尼松(10 mg/kg)連續(xù)灌胃給藥，致使小鼠免疫器官(胸腺和脾臟)萎縮，建立小鼠免疫抑制模型。連續(xù)給藥數(shù)天后，與空白組相比，模型組小鼠體重有減小的作用趨勢(shì)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，小鼠免疫器官指數(shù)有明顯降低趨勢(shì)且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，表明造模成功。

1.2.4 小鼠碳粒廓清實(shí)驗(yàn)

小鼠連續(xù)給藥14 d后，實(shí)驗(yàn)前6 h，禁食不禁水，于末次給藥后30 min，立即尾靜脈注射20%的印度墨汁(0.1 mL/10 g)，分別于2、12 min眼眶取血20 μL，立即溶于2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Na2CO3溶液中搖勻，置于波長(zhǎng)為680 nm處比色，測(cè)定其OD值，計(jì)算廓清指數(shù)(K)。K=(lgOD2-lgOD12)/(T12-T2)。

式中：OD2、OD12分別為2、12 min取血樣的OD值；T12-T2為所取血樣間隔的時(shí)間差[10]。

1.2.5 小鼠臟器指數(shù)及吞噬指數(shù)的測(cè)定

小鼠取血完成后，脫頸椎處死。取肝、脾臟及胸腺，用濾紙吸干其表面血漬，并精確稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)與吞噬指數(shù)(α)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體重，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體重，α=K1/3×體重/(肝重+脾重)[11]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 壓榨和萃取辣木籽油對(duì)小鼠體重的影響(見表1)

表1 壓榨和萃取辣木籽油對(duì)小鼠體重的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

給藥期間，各組小鼠毛色有光澤，活潑好動(dòng)，狀態(tài)較好，未出現(xiàn)不良反應(yīng)。由表1可看出：給藥期間，各組小鼠體重整體均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；但與空白組比較，給藥14 d后，模型組、壓榨與萃取辣木籽油聯(lián)合用藥各劑量組，小鼠體重顯著降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

2.2 壓榨和萃取辣木籽油對(duì)小鼠免疫器官質(zhì)量的影響(見表2)

由表2可看出：連續(xù)灌胃給藥14 d后，與空白組比較，壓榨與萃取辣木籽油高劑量組均顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，低劑量組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；模型組、壓榨與萃取辣木籽油聯(lián)合用藥各劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)明顯降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。與模型組比較，經(jīng)高劑量辣木籽油干預(yù)后免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均顯著升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；壓榨與萃取辣木籽油各劑量組小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)明顯高于模型組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，兩種提取工藝?yán)蹦咀延屯瑒┝拷M之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且具有等效性，不同劑量組之間呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

表2 壓榨和萃取辣木籽油對(duì)小鼠免疫器官質(zhì)量的影響

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。下同。

2.3 壓榨和萃取辣木籽油對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響(見表3)

由表3可看出：連續(xù)灌胃給藥14 d后，與空白組比較，壓榨與萃取辣木籽油高劑量組均提高小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，免疫抑制小鼠經(jīng)壓榨與萃取辣木籽油干預(yù)后小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)提高，且高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。兩種提取工藝?yán)蹦咀延屯瑒┝拷M之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，具有等效性，不同劑量組之間呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

表3 壓榨和萃取辣木籽油對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

2.4 壓榨和萃取辣木籽油對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞廓清功能的影響(見表4)

由表4可看出:連續(xù)灌胃給藥14 d后，與空白組相比，壓榨與萃取辣木籽油高劑量組小鼠巨噬細(xì)胞的廓清指數(shù)均升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；與模型組比較，免疫抑制小鼠經(jīng)高劑量壓榨與萃取辣木籽油干預(yù)后其巨噬細(xì)胞的廓清指數(shù)明顯提高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。其他各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，兩種提取工藝?yán)蹦咀延屯瑒┝拷M之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且具有等效性，不同劑量組之間呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。

表4 壓榨和萃取辣木籽油對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞廓清功能的影響

2.5 討論

人體的免疫功能是由免疫分子、免疫器官和免疫細(xì)胞等組成的系統(tǒng)共同參與并執(zhí)行，是機(jī)體的一種保護(hù)性生理反應(yīng)，能夠辨識(shí)自身并對(duì)抗外來物質(zhì)[12]。免疫有特異性與非特異性之分，前者是指在有外來抗原物質(zhì)如細(xì)菌、病毒等入侵機(jī)體時(shí)，與病原體發(fā)生的特異性反應(yīng)，是一種獲得性免疫；而后者為一種與生具有的天然性免疫，是人體防御系統(tǒng)的第二道防線[13]。研究表明，評(píng)價(jià)機(jī)體免疫效應(yīng)的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”之一是計(jì)算免疫器官(胸腺與脾臟)的臟器指數(shù)[14]。研究還表明，單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力可以衡量機(jī)體非特異性免疫功能，具體表現(xiàn)在吞噬指數(shù)、廓清指數(shù)的水平高低[15]。根據(jù)表1可知，用藥14 d后，與空白組比較，模型組、壓榨與萃取辣木籽油聯(lián)合用藥各劑量組小鼠體重顯著降低(P<0.01)，這是因?yàn)榇姿釢娔崴墒箼C(jī)體免疫降低的同時(shí)降低體重，這也證明本實(shí)驗(yàn)免疫抑制模型造模成功。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，辣木籽油除作為食用油外還具有抗氧化、降血糖及抗腫瘤等生理功效[16-17]，其給藥途徑多為靜脈注射或腹腔注射，經(jīng)口給藥的研究較少。腫瘤會(huì)影響機(jī)體的免疫功能，導(dǎo)致細(xì)胞免疫和體液免疫受到抑制，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中辣木籽油表現(xiàn)出很好的抗癌效果;而在體內(nèi)健康及免疫抑制狀態(tài)下的小鼠中，辣木籽油對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用未見報(bào)道。本文采用灌胃給藥途徑，并對(duì)兩種提取工藝的辣木籽油進(jìn)行對(duì)比研究。研究結(jié)果得出，經(jīng)口灌胃2周辣木籽油后并未影響小鼠體重，但對(duì)免疫器官質(zhì)量及巨噬細(xì)胞的吞噬能力有一定干預(yù)作用，證明兩種提取工藝的辣木籽油高劑量組(2 g/kg)均能明顯改善正常小鼠和免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)兩種提取工藝?yán)蹦咀延途哂械刃郧页尸F(xiàn)一定的劑量依賴性。但本文所采用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為正常小白鼠，而非裸鼠(沒有胸腺的模式動(dòng)物)，考慮實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便、成本及實(shí)驗(yàn)的側(cè)重點(diǎn)，免疫抑制動(dòng)物模型的建立是選用糖皮質(zhì)類激素藥物醋酸潑尼松而非環(huán)磷酰胺，后者更側(cè)重細(xì)胞免疫的抑制作用。基于以上非特異性免疫研究的結(jié)果，后期研究可能考察對(duì)細(xì)胞免疫的影響進(jìn)而綜合探究辣木籽油對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用，且其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

本文以兩種提取工藝(壓榨和超聲輔助溶劑萃取)制得的辣木籽油經(jīng)口連續(xù)灌胃小鼠14 d，通過測(cè)定小鼠體重、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)、碳粒廓清實(shí)驗(yàn)和巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取工藝制得的辣木籽油高劑量組(2 g/kg)均能顯著提高小鼠免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬清除能力。說明辣木籽油具有增強(qiáng)小鼠免疫的能力。