蘇彥蘋，趙 爽，齊國輝,3，李 寒,3，張雪梅,3，王寶慶

(1.廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 廊坊 065000； 2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；3.河北省核桃工程技術(shù)研究中心，河北 臨城 054300； 4.新疆林業(yè)科學(xué)院，烏魯木齊 830000)

核桃(JuglansregiaL.)又名胡桃，系胡桃科胡桃屬落葉喬木，為世界重要的木本油料樹種[1]。核桃種仁中氨基酸、脂肪酸及礦物質(zhì)含量豐富，具有較高的食用價值和醫(yī)療保健價值。新疆是我國核桃的主產(chǎn)區(qū)之一[2]，核桃資源豐富，再加上新疆獨(dú)特的生態(tài)地理環(huán)境使得新疆核桃備受青睞，進(jìn)而陸續(xù)被核桃科研工作者引種到國內(nèi)其他地區(qū)，目前我國很多優(yōu)良核桃品種中含有新疆核桃的血統(tǒng)[3]。

核桃種仁中的營養(yǎng)成分含量以脂肪最高，其次是蛋白質(zhì)。對于核桃種仁主要營養(yǎng)成分含量及差異的研究已有較多報道[4-8]，而關(guān)于核桃種仁中蛋白質(zhì)和氨基酸組分之間的關(guān)系以及評價和選育高蛋白核桃品種的研究相對較少。核桃中蛋白質(zhì)是一種必需氨基酸含量豐富的植物蛋白，作為核桃中的第二大營養(yǎng)成分，占核桃種仁質(zhì)量的14%～21%，所含氨基酸種類齊全，長期食用對人體健康有益[9-11]。在育種領(lǐng)域，高蛋白質(zhì)含量是品種選育中的一個非常重要的指標(biāo)，各種氨基酸在構(gòu)成蛋白質(zhì)的同時又相互轉(zhuǎn)化，分析蛋白質(zhì)和氨基酸組分之間的關(guān)系，闡明作用于蛋白質(zhì)含量的主要氨基酸種類以及作用方式，對明確蛋白質(zhì)與氨基酸之間的關(guān)系有著非常重要的意義，也對高蛋白核桃育種工作的推進(jìn)具有重要指導(dǎo)意義。通徑分析是定量研究變量間的因果關(guān)系或相關(guān)關(guān)系的一種有效工具，利用通徑分析研究核桃種仁中各氨基酸之間的相互關(guān)系及其與蛋白質(zhì)的相關(guān)性，對核桃育種有重要的指導(dǎo)意義。目前，關(guān)于蛋白質(zhì)與氨基酸相關(guān)性的研究僅限于小麥、花生、玉米等糧食作物[12-14]，在核桃上還未見報道，因此有必要更深入地分析核桃中的蛋白質(zhì)與氨基酸之間的關(guān)系，以便為核桃育種提供參考。

本文以26份新疆核桃種仁為原料，對其蛋白質(zhì)含量及氨基酸組分含量進(jìn)行方差分析，并通過相關(guān)性分析和通徑分析法解析了蛋白質(zhì)含量和氨基酸含量的相關(guān)性，以期為核桃高蛋白品種選育中親本的選配及優(yōu)良后代的篩選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試新疆核桃品種及來源如表1所示，于果實(shí)成熟期，采集每份核桃發(fā)育正常的果實(shí)30個作為試驗(yàn)材料，手工脫青皮，將核桃恒溫烘干后去殼，用粉碎機(jī)粉碎均勻后置于4 ℃保存，供各項指標(biāo)的測定。

表1 供試新疆核桃品種及來源

18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%)，購自美國Sanland公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，購自美國安捷倫公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 指標(biāo)的測定

蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法，依照GB 5009.5—2010進(jìn)行；氨基酸組成測定采用高效液相色譜法，參照李娜[15]的方法進(jìn)行；色氨酸采用高效液相色譜法單獨(dú)測定，色譜條件參照李娜[15]的方法，測定之前按以下步驟進(jìn)行樣品處理：將核桃樣品用粉碎機(jī)粉碎過60目篩，索氏抽提脫脂后，稱取0.2 g樣品于安瓿瓶中，加入5 mol/L的氫氧化鈉10 mL，馬上擰緊瓶蓋，放入110℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中水解24 h，取出冷卻后，將水解液轉(zhuǎn)移到25 mL的容量瓶中，調(diào)節(jié)pH至4.3左右，用乙酸鈉緩沖液定容，搖勻，在4 000 r/min離心10 min,取上清液過有機(jī)膜2次。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及處理方法

蛋白質(zhì)及氨基酸含量分析采用單因素方差分析(ANOVA)及Duncan新復(fù)極差法多重比較，蛋白質(zhì)含量和各氨基酸組分含量間的關(guān)系采用相關(guān)性分析和通徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新疆核桃種仁蛋白質(zhì)及氨基酸含量

對26份新疆核桃種仁蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成及含量分別進(jìn)行測定，結(jié)果如表2～表4所示。

由表2可知，26份新疆核桃種仁的蛋白質(zhì)含量為8.86～19.70 g/100 g，其中‘扎74’的蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到19.70 g/100 g，是蛋白質(zhì)含量最低的‘優(yōu)21’的2.2倍?！?4’‘烏什49’‘扎343’‘95’‘溫185’‘扎210’‘新新2’‘優(yōu)30’‘阿育王’及‘大葉型’核桃種仁蛋白質(zhì)含量大于14 g/100 g，達(dá)到國家核桃堅果質(zhì)量特級標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)含量較高。為有效開發(fā)高蛋白核桃資源，可將這些核桃資源用于加工核桃蛋白飲料、核桃蛋白片等產(chǎn)品，以延長核桃產(chǎn)業(yè)鏈，增加附加值。

表2 26份新疆核桃種仁蛋白質(zhì)含量

g/100 g

表3 26份新疆核桃種仁氨基酸組成及含量 g/100 g

注：氨基酸組成中未測定酪氨酸含量；Thr.蘇氨酸；Val.纈氨酸；Met.蛋氨酸；Ile.異亮氨酸；Leu.亮氨酸；Phe.苯丙氨酸；Lys.賴氨酸；Trp.色氨酸;His.組氨酸；Arg.精氨酸；Asp.天冬氨酸；Glu.谷氨酸；Ser.絲氨酸；Pro.脯氨酸；Ala.丙氨酸；Gly.甘氨酸；Cys.半胱氨酸。下同。

表4 26份新疆核桃種仁必需氨基酸(EAA)、半必需氨基酸(HEAA)、非必需氨基酸(NEAA)及總氨基酸(TAA)含量 g/100 g

由表3可知，新疆核桃種仁中含有蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸及色氨酸8種必需氨基酸(EAA)，組氨酸和精氨酸2種半必需氨基酸(HEAA)，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、半胱氨酸7種非必需氨基酸(NEAA)，共17種氨基酸，表明核桃中氨基酸組成十分豐富。其中以谷氨酸和精氨酸含量較為豐富，含量均在1 g/100 g以上。由表4可知，26份新疆核桃種仁EAA含量在2.14 ～4.55 g/100 g，差異較大，‘烏什49’的EAA含量最高，‘溫185’‘紙皮’‘烏417’的EAA含量最低?！?4’的HEAA含量和NEAA含量最高，分別為3.78、10.05 g/100 g。新疆核桃總氨基酸(TAA)含量在7.83～16.92 g/100 g，含量較高的是‘扎74’‘烏什49’，分別為16.92、16.35 g/100 g，均為‘優(yōu)21’的2倍以上。

2.2 氨基酸與蛋白質(zhì)的關(guān)系

2.2.1 相關(guān)性分析

對各氨基酸含量與蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果如表5所示。

表5 各氨基酸含量與蛋白質(zhì)含量的相關(guān)系數(shù)

注：**表示在0.01水平有極顯著差異(P<0.01)。

由表5可知，異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸含量與蛋白質(zhì)含量呈較弱的負(fù)相關(guān)，其余13種氨基酸均與蛋白質(zhì)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)性由強(qiáng)到弱依次為：甘氨酸(0.906)>精氨酸(0.901)>谷氨酸(0.890)>絲氨酸(0.871)>天冬氨酸(0.870)>蘇氨酸(0.834)>纈氨酸(0.831)>脯氨酸(0.829)>丙氨酸(0.801)>組氨酸(0.787)>半胱氨酸(0.763)>苯丙氨酸(0.754)>蛋氨酸(0.679)，這與楊慶利等[13]對花生種子中蛋白質(zhì)含量和多數(shù)氨基酸含量呈正相關(guān)的結(jié)果近似，同時也與賴麟等[14]對玉米種子中蛋白質(zhì)和氨基酸含量關(guān)系較一致，但是就不同植物的種子或果實(shí)來說，各氨基酸與蛋白質(zhì)的相關(guān)系數(shù)有一定差異，這可能是由于不同植物果實(shí)或種子的蛋白質(zhì)含量及各氨基酸組分含量不同的原因。

2.2.2 通徑分析

通徑分析常用于分析多變量間的相關(guān)關(guān)系，其通過通徑系數(shù)能有效地表示相關(guān)變量間的直接影響或間接影響效應(yīng)的大小，從而區(qū)分因子的相對重要性及其關(guān)系。本研究為探明各氨基酸組分與蛋白質(zhì)含量間的關(guān)系，先以17種氨基酸作為蛋白質(zhì)構(gòu)成因子，通過逐步回歸分析，篩選出12種對蛋白質(zhì)含量(Y)影響顯著的氨基酸，擬合線性方程為Y=11.496-37.229X2- 16.031X3-18.409X4+10.335X5+15.564X7-8.097X8+15.362X10+43.484X11-10.224X12-56.928X15+13.479X16-46.603X17。該擬合方程的復(fù)相關(guān)指數(shù)(R)為0.97，決定系數(shù)(R2)為0.94，接近于1，即12種氨基酸對蛋白質(zhì)含量影響的比重占94%，表明對蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生影響的主要因子已充分考慮進(jìn)去。對12種氨基酸進(jìn)行通徑分析，結(jié)果見表6。由表6可知，從12種氨基酸的直接通徑系數(shù)絕對值來看，天冬氨酸的通徑系數(shù)最大(4.447)，其次是精氨酸(3.052)，表明天冬氨酸和精氨酸對蛋白質(zhì)含量的直接影響較大。結(jié)合直接通徑系數(shù)和間接通徑系數(shù)綜合評價各氨基酸對蛋白質(zhì)含量的影響，結(jié)果表明：谷氨酸、纈氨酸、丙氨酸、精氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸均是主要通過影響天冬氨酸對蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生間接影響，間接通徑系數(shù)由大到小依次為4.421>4.389>4.369>4.357>4.313>3.810>3.297；亮氨酸直接對蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生影響，直接通徑系數(shù)為1.750，異亮氨酸和色氨酸通過影響亮氨酸對蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生間接影響，間接通徑系數(shù)分別為1.748和0.546；賴氨酸通過影響丙氨酸對蛋白質(zhì)產(chǎn)生間接影響，間接通徑系數(shù)為-0.678。天冬氨酸是對蛋白質(zhì)含量影響最大的氨基酸，且是直接影響，通徑系數(shù)為4.447；其次是谷氨酸，其主要通過影響天冬氨酸含量間接影響蛋白質(zhì)含量，通徑系數(shù)為4.421。因此，在進(jìn)行高蛋白核桃品種選育時可以將天冬氨酸和谷氨酸含量高的核桃資源作為親本，在基因工程育種中也可以克隆與天冬氨酸或谷氨酸高效合成相關(guān)的基因進(jìn)行高蛋白核桃品種的創(chuàng)制，這樣可能會有效地提高核桃育種中蛋白質(zhì)構(gòu)成的改良效率。與相關(guān)性分析法相比，通徑分析法是在剔除了影響非顯著性影響因子之后進(jìn)行的分析，因而結(jié)果更準(zhǔn)確。

表6 氨基酸含量與蛋白質(zhì)含量的通徑系數(shù)

注：X2、X3、X4、X5、X7、X8、X10、X11、X12、X15、X16、X17分別代表纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸和半胱氨酸；帶有下劃線的數(shù)據(jù)為氨基酸組分對蛋白質(zhì)的直接通徑系數(shù)，不帶下劃線的數(shù)據(jù)為間接通徑系數(shù)。

3 結(jié) 論

26份新疆核桃種仁中蛋白質(zhì)含量在8.86～19.70 g/100 g，10份核桃蛋白質(zhì)含量達(dá)到國家核桃堅果質(zhì)量特級標(biāo)準(zhǔn)。核桃種仁蛋白質(zhì)中含有17種氨基酸(酪氨酸未檢測)，以谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量較為豐富，EAA含量在2.14～4.55 g/100 g， TAA含量在7.83～16.92 g/100 g。通過對蛋白質(zhì)含量與氨基酸含量進(jìn)行通徑分析，發(fā)現(xiàn)天冬氨酸和谷氨酸含量對蛋白質(zhì)含量的影響較大，在核桃育種中可通過采取提高天冬氨酸和谷氨酸含量的策略增加核桃蛋白質(zhì)含量。