夏日耀,梁 棋,杜蓮朵,張建軍,羅秋水,2,杜 娟,2,熊建華,2,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045; 2.南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室,江西南昌 330045)

腌制魚是我國傳統(tǒng)的風(fēng)味加工食品,在其加工和貯藏過程中,由于亞硝酸鹽和胺類的相互作用,會產(chǎn)生一類化學(xué)物質(zhì)——N-亞硝胺[1]。其在人體內(nèi)長期積累會誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變[2-3]。根據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)對致癌物質(zhì)的分類,NDMA和NDEA屬于2A 類致癌物,N-亞硝基甲乙胺(N-Nitroso-methylethylamine,NMEA)、N-亞硝基二丙胺(N-Nitrosodi-n-propylanime,NDPA)、N-亞硝基二丁胺(N-Nitrosodibutylamine,NDBA)、NPIP、N-亞硝基嗎啉(N-Nitrosomorpholine,NMOR)和NPYR屬于2B類致癌物,N-亞硝基二苯胺(N-Nitrosodiphenylamine,NDPhA)屬于3類致癌物[4]。這9種物質(zhì)是食品中常見的揮發(fā)性N-亞硝胺[5],因此,對于它們的檢測研究一直是食品安全檢測領(lǐng)域的熱點。目前,我國對食品中存在N-亞硝基二甲胺(NDMA)有限量規(guī)定,即肉制品<3 μg/kg和水產(chǎn)制品<4 μg/kg[6]。

目前,肉制品中N-亞硝胺的檢測主要通過色譜結(jié)合特異性檢測器或者色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行,常見的檢測方法有氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8],氣相色譜-氫火焰檢測器法(GC-FID)[9]、氣相色譜-氮磷檢測器法(GC-NPD)[10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法(LC-MS)[11-13]。其中,GC-FID和GC-NPD是實驗室常見儀器,但檢測結(jié)果受樣品雜質(zhì)干擾較大,使其用于N-亞硝胺類化合物的檢測時出現(xiàn)靈敏度較低、檢出限較高的缺陷[14]。GC-TEA法儀器專用性強(qiáng),且價格昂貴[15]。GC-MS法和LC-MS法選擇性好,且靈敏度高[16-17],但一般的實驗室難以配備。在樣品提取方法上,肉制品中常見的N-亞硝胺類化合物提取方法主要有水蒸氣蒸餾法[18]和有機(jī)試劑超聲提取法[19]。水蒸氣蒸餾法的樣品基質(zhì)效應(yīng)小,但提取時間較長,易造成部分成分揮發(fā)且操作繁瑣。有機(jī)試劑提取法操作簡單快捷,提取試劑需求量小,但提取液中N-亞硝胺類化合物濃度低,只適用于高靈敏度的檢測儀器。因此越來越多的研究開始著重于對樣品處理方法的改進(jìn)。本文采用二氯甲烷作為提取腌制魚干中N-亞硝胺的溶劑,優(yōu)化提取、除雜工藝,經(jīng)C18SPE小柱的富集,使較低劑量的N-亞硝胺類化合物能夠在氣相色譜-氫火焰檢測器上檢出,滿足一般實驗室對于腌制食品N-亞硝胺類化合物安全性的檢測需求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腌制魚干 市售,粉碎過40目篩;N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品(2000 mg/L,1 mL):N-亞硝基二甲胺(NDMA)、N-亞硝基甲乙胺(NMEA)、N-亞硝基二乙胺(NDEA)、N-亞硝基二丙胺(NDPA)、N-亞硝基二丁胺(NDBA)、N-亞硝基哌啶(NDIP)、N-亞硝基吡咯烷(NPYR)、N-亞硝基嗎啉(NMOR)、N-亞硝基二苯胺(NDPhA) (純度>99%),美國O2si公司;C18SPE小柱 美國Waters公司;Ba(OH)2·8H2O 上海麥克林生物科技公司;二氯甲烷 色譜純,山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;椰殼活性炭 河南祥源水處理材料有限公司;β-環(huán)狀糊精 上海阿拉丁生化科技有限公司。

Agilent GC-7890B氣相色譜儀(FID檢測器)、SPE固相萃取裝置 美國AgilentTechnologies公司;HC-2518R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫烘箱 德國Binder公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;WH-12水浴氮氣吹干儀 浙江余姚振興流量儀表廠;JZM-JR351絞肉機(jī) 廣東飛旺電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

1.2.1.1 GC條件 色譜柱:DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:初始溫度40 ℃保持4 min;以4 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,再以20 ℃/min升至200 ℃,保持13.5 min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;載氣(N2)流速:5.462 mL/min;隔墊吹掃流量:3 mL/min;進(jìn)樣分流比:1∶1;進(jìn)樣量:5.0 μL。

1.2.1.2 檢測器條件 FID檢測器溫度:250 ℃;空氣流量:400 mL/min;燃?xì)?H2)流量:40 mL/min;尾吹氣(N2)流量:30 mL/min;恒定尾吹。

1.2.2 對照品溶液的制備 將N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品(2000 mg/L,1 mL)用二氯甲烷稀釋定容至1000 mL容量瓶中,得到N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(2.0 mg/mL),-20 ℃棕色瓶中保存。準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用二氯甲烷逐級稀釋配制成濃度范圍為0.05～5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.1色譜條件進(jìn)樣分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以信噪比為3和10時的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為定量限和檢出限。

1.2.3 供試品溶液的制備

1.2.3.1 試品中N-亞硝胺的提取 稱取適量腌制魚干粉,分別用水蒸氣蒸餾法、有機(jī)試劑超聲提取法、堿液處理結(jié)合二氯甲烷萃取法對樣品進(jìn)行提取,比較提取方法。

水蒸氣蒸餾法:搭好水蒸氣蒸餾裝置。稱取200 g樣品,加入100 mL水和50 g氯化鈉于蒸餾瓶中,混勻并檢查氣密性。取100 mL二氯甲烷及少量冰塊至于500 mL錐形瓶中。將冷凝管出口伸入二氯甲烷液面下,錐形瓶冰浴。開啟蒸餾裝置加熱,收集400 mL冷凝液后停止蒸餾。

有機(jī)試劑超聲提取法:稱取200 g樣品置于500 mL離心瓶中,加入200 mL二氯甲烷,擰緊瓶蓋后渦旋混勻1 min,將離心瓶至于超聲波提取器中超聲30 min,離心分出上清液,再加入150 mL二氯甲烷重復(fù)提取2次。合并上清液。

堿液處理萃取法:稱取200 g樣品置于500 mL離心瓶中,加入30 g Ba(OH)2·8H2O、200 mL超純水,擰緊瓶蓋后渦旋混勻1 min。置于90 ℃恒溫烘箱處理1.5 h。取出離心瓶,靜置冷卻10 min后,以10000 r/min離心10 min,取上清液,加入40 mL二氯甲烷,渦旋混勻1 min后離心,將上層水溶液分離出后加入30 mL二氯甲烷重復(fù)萃取離心2次,合并所有二氯甲烷提取液。

1.2.3.2 樣品凈化 在二氯甲烷提取液中加入除雜材料,混勻靜置后5000 r/min離心5 min將材料分離,除雜材料中再加10 mL二氯甲烷淋洗10 min,收集合并所有二氯甲烷。以無水硫酸鈉做脫水過濾處理,濾液30 ℃真空濃縮至5 mL。使用C18SPE小柱進(jìn)行富集,定容至1 mL,過0.22 μm有機(jī)濾膜,待測。

1.2.4 回收率與精密度 選擇湖南臘魚、安徽農(nóng)家風(fēng)干魚、湖北風(fēng)味魚干三種樣品進(jìn)行三水平添加實驗,計算樣品的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 實際樣品檢測 采用本實驗方法對市場上銷售的50種腌制魚干進(jìn)行分析檢測,每種樣品做3次平行實驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent GC-7890B氣相色譜儀脫機(jī)系統(tǒng)和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,色譜峰圖用Origin 2017繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的優(yōu)化 選擇了3種不同的氣相色譜柱:非極性柱HP-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、中等極性柱DB-624(30 m×0.25 mm,0.25 μm)、強(qiáng)極性柱DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 μm)對N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分離實驗,色譜圖如圖1～圖3所示。結(jié)果表明,非極性柱HP-5(30 m×0.25 mm,0.25 μm)分離出的N-亞硝胺類化合物峰形不對稱,有明顯的拖尾現(xiàn)象,且目標(biāo)物有疊峰現(xiàn)象;中等極性柱DB-624(30 m×0.25 mm,0.25 μm)的N-亞硝胺類化合物峰形仍有拖尾現(xiàn)象,目標(biāo)物未能完全分離。強(qiáng)極性柱DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 μm)的目標(biāo)物色譜峰峰形對稱,分離效果好,這可能是因為N-亞硝胺類化合物的分子極性強(qiáng),且具有強(qiáng)揮發(fā)性,強(qiáng)極性柱DB-WAXETR對N-亞硝胺類化合物具有一定的吸附作用,能實現(xiàn)更好的分離[20-21]。故選用強(qiáng)極性柱DB-WAXETR(30 m×0.25 mm,0.25 μm)作為色譜分離柱。

圖1 非極性柱HP-5的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 The chart for weak polar columnHP-5 of standard mixed solution

圖2 中等極性柱DB-624的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 The chart for medium polar columnDB-624 of standard mixed solution

圖3 強(qiáng)極性柱DB-WAXETR的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.3 The chart for strong polar columnDB-WAXETR of standard mixed solution

2.1.2 柱溫升溫速率的優(yōu)化 9種N-亞硝胺化合物的分子量在74.08到198.22之間,由于與氨基連接的基團(tuán)差異不同,其極性和沸點跨度較大,為使其在色譜柱上達(dá)到更好的分離,需優(yōu)化柱溫的升溫速率。設(shè)置初始溫度為50 ℃,分別選擇16、8、4、2 ℃/min為初始升溫速率。結(jié)果表明,當(dāng)升溫速率為16 ℃/min時,溶劑峰與NDMA未能分離;當(dāng)升溫速率為8 ℃/min時,溶劑峰與NDMA開始分離,但分離效果一般;降低升溫速率為4 ℃/min,溶劑峰與NDMA分離效果良好;繼續(xù)降低升溫速率為2 ℃/min,分離效果無明顯變化,為提高程序效率,故選擇4 ℃/min為初始升溫速率。當(dāng)升溫至120 ℃時,相對低沸點的4種N-亞硝胺類化合物已經(jīng)出峰,此時提高升溫速率為20 ℃/min升至200 ℃,并保持13.5 min,9種N-亞硝胺可分別出峰,達(dá)到較好的分離。因此,最終升溫程序為:初始溫度40 ℃保持4 min;以4 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,再以20 ℃/min升至200 ℃,保持13.5 min。

2.1.3 載氣分流比的優(yōu)化 由于氫火焰離子檢測器相較于質(zhì)譜靈敏度較低,因此,檢測方法既要保證良好的分離效果,也要提高目標(biāo)物的相對豐度。調(diào)整載氣分流比是控制目標(biāo)物分離效果和相對豐度的主要途徑之一,分流比越大,峰的分離度越好,但相對豐度越小[22]。實驗對比了分流比為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和不分流7種分流方式對目標(biāo)物出峰效果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)分流比為不分流時,NDBA、NDIP、NPYR出現(xiàn)疊峰的現(xiàn)象;當(dāng)分流比為1∶1時,9種N-亞硝胺分離度和相對豐度均良好;繼續(xù)增大分流比后,9種N-亞硝胺雖都能實現(xiàn)有效的分離,但相對豐度逐漸變小;因此選擇1∶1為載氣分流比。

9種N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)過優(yōu)化后的方法得到如圖4色譜圖,表1為進(jìn)一步采用GC-MS對9種N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)樣定性。

圖4 9種N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的氣相色譜圖Fig.4 The chart for gas chromatography ofnine kinds of N-nitrosamines standard mixed solution

表1 9種N-亞硝胺的保留時間和定性定量離子表Table 1 Retention time,qualitative andquantitativeion for nine N-nitrosamines

2.2 樣品預(yù)處理的選擇

2.2.1 提取方法的優(yōu)化 由于氫火焰檢測器靈敏度低,因此本實驗的取樣量要大于配備質(zhì)譜等高靈敏度儀器的檢測方法。而腌制魚干的樣品基質(zhì)復(fù)雜,不僅自身含有一定量的油脂,產(chǎn)品還會加入一定量的食用油調(diào)味,樣品提取的干擾因素較多。實驗比較了水蒸氣蒸餾法、有機(jī)試劑超聲提取法和堿液處理結(jié)合二氯甲烷萃取法對200 g腌制魚干的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),水蒸氣蒸餾法所得的提取液雜質(zhì)較少,但實驗操作復(fù)雜繁瑣,提取耗時長,N-亞硝胺類化合物受熱時間較長損失較大;有機(jī)試劑超聲提取法操作簡單快捷,但提取使用的有機(jī)溶劑消耗量較大,且提取液中的油脂較多,給下一步的凈化處理增加難度;堿液處理萃取法則通過堿液加熱處理,將N-亞硝胺類化合物提取至水溶液的同時,皂化樣品中的大部分油脂,之后將水溶液中的N-亞硝胺類化合物萃取至有機(jī)溶劑當(dāng)中[23-25],提取液中干擾物相對較少,并且此方法相對水蒸氣蒸餾法耗時較短,消耗的有機(jī)溶劑量相對超聲提取法少,因此選擇堿液處理萃取法作為樣品的提取方法。

2.2.2 除雜材料的篩選 由于取樣量較大,堿液處理萃取法獲得的提取液依然含有一定量的油脂和其他干擾物質(zhì),不能直接進(jìn)行固相小柱富集。研究表明,椰殼活性炭能有效吸附油脂,雖對水中的N-亞硝胺類化合物也有一定的吸附作用[26],但這部分N-亞硝胺可以利用二氯甲烷洗脫,能較好地除去油脂。β-環(huán)狀糊精能將油脂吸附在其疏水穴內(nèi)形成球狀復(fù)合物[27],再經(jīng)過濾分離,是去除油脂的有效材料。

本實驗于100 mL二氯甲烷提取液中加入1 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(4 μg/mL),并使用10、15、20 g三個濃度添加量的椰殼活性炭、β-環(huán)狀糊精進(jìn)行除雜處理,再經(jīng)C18SPE小柱富集,濃縮至1 mL測定,計算加標(biāo)回收率。如表2所示,兩種材料對提取液均有一定的除雜效果,但椰殼活性炭處理后的9種N-亞硝胺類化合物的加標(biāo)回收率總體要高于β-環(huán)狀糊精,選擇椰殼活性炭作為除雜材料。10和15 g椰殼活性炭處理后的9種N-亞硝胺類化合物平均回收率分別為85.57%和85.49%,二者相差不大,而20 g椰殼活性炭處理后的9種N-亞硝胺類化合物的回收率較低。10 g椰殼活性炭處理后的提取液混濁,雜質(zhì)仍然較多,除雜效果低于15 g椰殼活性炭。因此,選擇15 g椰殼活性炭作為除雜材料濃度添加量。

表2 兩種材料處理后的9種N-亞硝胺的回收率Table 2 The recoveries of nineN-nitrosamines in treated two materials

2.3 線性關(guān)系、檢出限、定量限

根據(jù)實測樣品的取樣量,用混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制濃度范圍為0.05～5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以信噪比為3和10時的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為定量限和檢出限。結(jié)果如表3所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均>0.999。9種N-亞硝胺的檢出限和定量限范圍分別為0.05～0.29和0.18～0.95 μg/mL。王瑞等[28]使用水蒸氣蒸餾法結(jié)合GC-FID檢測器檢測熟肉中的NDEA,其檢測限為0.8 μg/mL。本研究的NDEA的檢測限(0.12 μg/mL)遠(yuǎn)低于其結(jié)果,說明本檢測方法有一定的優(yōu)越性。

表3 9種N-亞硝胺類化合物的線性關(guān)系、檢出限、定量限Table 3 Linear relationship,limits of detection and limits of quantification for nine N-nitrosamines

以實測樣品的取樣量換算,本試驗方法的NDMA的檢出限為1.45 μg/kg,根據(jù)GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》,干制水產(chǎn)制品中NDMA 的限量規(guī)定為4 μg/kg,該方法的檢出限能滿足腌制水產(chǎn)制品中N-亞硝胺類化合物檢測的需要。

2.4 回收率和精密度

選擇湖南臘魚、安徽農(nóng)家風(fēng)干魚、湖北風(fēng)味魚干三種樣品進(jìn)行添加實驗,分別以5、10、15 μg/kg N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品為添加水平,計算樣品的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果見表4。9種N-亞硝胺的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為76.8%～129.5%和2.29%～15.5%。根據(jù)GBT 27404-2008《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測 附錄F》中所規(guī)定的食品中禁用物質(zhì)的范圍要求,當(dāng)被測組分含量小于100 μg/kg時,回收率需>60%[29],說明該方法回收率符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

表4 樣品中9種N-亞硝胺的回收率及精密度(n=6)Table 4 The recoveries and precision of nine N-nitrosamines(n=6)in samples

2.5 樣品檢測

采用本實驗方法對市場上銷售的50種腌制魚干進(jìn)行分析檢測,每種樣品做3次平行實驗,結(jié)果見表5。腌制魚干NDEA、NDIP、NPYR的檢出率相對較高,分別達(dá)到20%、20%、24%。其中NDEA和NPYR含量最高達(dá)20.54 μg/kg和15.85 μg/kg,NDIP的最高含量相對較低為4.32 μg/kg。NDBA、NDMA和NMEA檢出率分別為14%、10%、8%。最高含量分別為7.54、5.12、3.42 μg/kg。NDPA和NDPhA的檢出率較低,含量均在檢測限以下,NMOR未檢出。說明腌制魚干中NDEA、NDIP、NPYR普遍存在。目前國標(biāo)只對水產(chǎn)動物性制品中NDMA有具體的限量4 μg/kg,50種腌制魚干只有一種超過標(biāo)準(zhǔn)。其中黃花魚干的色譜圖見圖5。

表5 50種腌制魚干中的9種N-亞硝胺檢測結(jié)果Table 5 Detection results of nineN-nitrosamines in pickling fish

圖5 黃花魚干的色譜圖Fig.5 Chromatogram of dried yellow croaker

3 結(jié)論

本研究優(yōu)選了樣品提取方法、除雜材料,比較了不同極性的色譜柱對9種N-亞硝胺類化合物的分離效果,優(yōu)化了檢測條件,建立了氣相色譜-氫火焰檢測器同時測定腌制魚干的9種N-亞硝胺類化合物的方法。該方法相對國標(biāo)方法操作簡單,NDMA檢出限低于國標(biāo)中干制水產(chǎn)制品NDMA 的限量規(guī)定,降低了檢測腌制魚干中N-亞硝胺類化合物的儀器需要,能夠?qū)崿F(xiàn)一般實驗室對N-亞硝胺化合物的安全性檢測。采用本方法對市售的50種腌制魚干進(jìn)行了樣品檢測,NDEA、NDIP、NPYR檢出率分別達(dá)到20%、20%、24%,NDBA、NDMA和NMEA檢出率分別為14%、10%、8%。NDPA和NDPhA的檢出率較低,含量均在檢測限以下。NMOR未檢出。只有一種樣品的NDMA超過國標(biāo)限量規(guī)定。