曾瑤英,邵曉露,成淑君,余 倩

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院,廣東廣州 510225)

果蔬植物病害嚴(yán)重影響果實(shí)產(chǎn)量與品質(zhì),限制農(nóng)業(yè)更好發(fā)展。但化學(xué)農(nóng)藥對(duì)果蔬植物進(jìn)行防治時(shí),往往造成環(huán)境污染,病害蟲產(chǎn)生抗性,同時(shí)帶來農(nóng)藥殘留等問題。植物源農(nóng)藥源于植物提取物,具有污染小、毒性小、病蟲不易產(chǎn)生抗性、防治效率高等優(yōu)點(diǎn),已成為現(xiàn)今研究的熱門[1-3]。植物源農(nóng)藥是指按一定的方法從植物中提取出殺菌物質(zhì)及其次生代謝產(chǎn)物加工而成的中藥制劑,含有的抑菌成分復(fù)雜,且不同抑菌成分之間會(huì)產(chǎn)生協(xié)同增效作用[1]。靚果安作為一種新型的植物源農(nóng)藥,是由黃連、金銀花、黃芩、黃柏等二十多種中藥材提取而制得,里面還有硫、鈣和鋅等礦物質(zhì),具有價(jià)格低廉、毒副作用小、易分解和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。鄒秀華等[4]研究表明,靚果安對(duì)核桃潰瘍病、桃樹流膠病以及蘋果果實(shí)輪紋病都有很好的防治效果并強(qiáng)壯樹體。張萍等[5]研究表明,2.6%的單一或混用靚果安可防治40%～63%的香梨腐爛病。但迄今為止,關(guān)于靚果安在實(shí)驗(yàn)室條件下的抑菌效果以及抑菌機(jī)理的研究還未有報(bào)道。由于單一生物農(nóng)藥的抗菌性較差,通過復(fù)配農(nóng)藥助劑不僅能有效利用現(xiàn)有資源,更能減少投入成本,提高產(chǎn)品性能,增大抑菌譜。農(nóng)藥助劑在病蟲害防治過程中發(fā)揮著重要作用,每種農(nóng)藥助劑都有特定的功能,如稀釋原液,防止粒滴凝聚變大,增加粒子滲透性、潤(rùn)濕性或粘黏性,預(yù)防施藥不安全等[6]。

大蒜油是由大蒜壓榨而得到的一種油狀物,研究發(fā)現(xiàn)大蒜油具有強(qiáng)抗菌能力,是一種廣譜性抗菌物[7]。大蒜油抗菌原理研究十分透徹,大蒜油中的硫醚化合物、大蒜辣素(C6H10OS2)、大蒜新素(C6H10S3)、α-水芹和醛類化合物等成分對(duì)大多數(shù)細(xì)菌具有抑制作用。大蒜油抑菌原理主要是活性成分中含有的硫醚基(S-O-S),在硫醚基(S-O-S)進(jìn)入細(xì)胞后,細(xì)胞中的巰基被氧化成二硫鍵,影響細(xì)胞正常的生理代謝,抑制細(xì)胞繼續(xù)分裂進(jìn)而起到殺菌的作用[8-9]。

本文選取安全低毒的生物農(nóng)藥?kù)n果安復(fù)配農(nóng)藥助劑大蒜油作為殺菌劑,通過試驗(yàn)選出最佳復(fù)配組合,降低農(nóng)藥使用量;與此同時(shí)進(jìn)行光鏡下菌體形態(tài)的觀察和投射電鏡下細(xì)胞微結(jié)構(gòu)的觀察來探究抑菌劑的抑菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靚果安、大蒜油 濰坊奧豐作物病毒防治有限公司;PBS緩沖液 北京雷根生物技術(shù)有限公司;草酸銨結(jié)晶紫染色液、革蘭氏碘液、95%乙醇、復(fù)紅染液 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;金黃色葡萄球菌菌種來源ATCC6538、大腸桿菌菌種來源ATCC6538 上海魯微科技有限公司。

ACQUITY UPLC型液相色譜儀 美國(guó) Waters公司;Triple-TOFTM5600+型質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司;生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司;紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;投射電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 活化菌種及制備菌懸液 在超凈工作臺(tái)上將2株供試菌種(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)24 h。

利用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲汽準(zhǔn)媳葷峁?分光光度計(jì)法測(cè)量不同比濁管的吸光度[10-13],制備好的麥?zhǔn)媳葷峁?用紫外分光光度計(jì)(波長(zhǎng)600 nm)測(cè)量不同比濁管的吸光度值,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0812x+0.164(R2=0.9943),比濁管的濁度與OD值、比濁管的濁度與菌懸液的濁度呈線性關(guān)系,而菌懸液的濁度與細(xì)菌菌落數(shù)呈正相關(guān),因此菌懸液的細(xì)菌菌落數(shù)可利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的吸光值計(jì)算得知。

挑取少量細(xì)菌菌落于無(wú)菌生理鹽水中,振蕩5 min,利用分光光度計(jì)測(cè)量其吸光值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線用生理鹽水調(diào)整其濃度至1.5×108～3.0×108CFU/mL,再稀釋菌懸液濃度至106～107CFU/mL。

1.2.2 抑菌圈的測(cè)定方法 參考陳度煌[14]的方法,在此方法上進(jìn)行改良。將適量營(yíng)養(yǎng)瓊脂倒入平板,凝固后,取100 μL菌懸液,用涂布棒涂布均勻后,將牛津杯平穩(wěn)放置已涂布菌懸液的平皿上,加入200 μL抑菌劑,蓋好平皿蓋,置于37 ℃培養(yǎng)箱,培養(yǎng)24 h。

1.2.3 最低抑菌濃度的測(cè)定 體外培養(yǎng)細(xì)菌18～24 h,抑制細(xì)菌生長(zhǎng)所需藥物的最低濃度稱為最低抑菌濃度[15](Minimum inhibitory concentration,MIC),是測(cè)量抑菌試劑的抑菌作用大小的指標(biāo)。

1.2.3.1 靚果安抑菌劑MIC的測(cè)定 以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為待測(cè)菌株,無(wú)菌水為空白對(duì)照,靚果安用無(wú)菌水稀釋成濃度為80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0 mg/mL的抑菌液,取1 mL于裝有9 mL牛肉膏蛋白胨的錐形瓶中,搖勻后,趁熱倒平板,待平板冷卻凝固后,吸取濃度106～107CFU/mL的各菌懸液100 μL于牛肉膏蛋白胨平皿中,用涂布棒均勻涂抹,倒置放于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以培養(yǎng)皿中不長(zhǎng)菌時(shí)抑菌劑的濃度確定為最低抑菌濃度,即MIC。

1.2.3.2 大蒜油抑菌劑MIC的測(cè)定 方法同1.2.3.1,大蒜油對(duì)金黃色葡萄球菌MIC測(cè)定:大蒜油用無(wú)菌水稀釋成濃度為6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0 mg/mL;大蒜油對(duì)大腸桿菌MIC測(cè)定:大蒜油用無(wú)菌水稀釋成濃度為51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0 mg/mL。

1.2.3.3 復(fù)配液部分抑菌濃度指數(shù) 部分抑菌濃度(Fractional inhibitory concentration,FIC)指數(shù)為抗菌藥藥效學(xué)參數(shù)之一,是兩種抗菌藥的聯(lián)合藥敏指標(biāo)[16]。本實(shí)驗(yàn)旨在判斷兩種抑菌劑復(fù)配使用后是否達(dá)到協(xié)同作用。

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為待測(cè)菌株,利用棋盤法[17],分別將0.5 mL濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 MIC的靚果安稀釋液和0.5 mL濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078125 MIC的大蒜油稀釋液進(jìn)行復(fù)配,得到1 mL復(fù)配液,將復(fù)配液加入含有9 mL牛肉膏蛋白胨的錐形瓶中,使其最終各組分濃度為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125 MIC,均勻搖動(dòng),趁熱倒平板,待平板冷卻凝固后,吸取濃度106～107CFU/mL的各菌懸液100 μL于牛肉膏蛋白胨平皿中,用涂布棒均勻涂抹,倒置放于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以無(wú)肉眼可見菌落的最低抑菌劑稀釋液濃度為復(fù)配液對(duì)兩株供試菌株的最低抑菌濃度(MIC)。

觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,得到各個(gè)抑菌劑復(fù)配使用時(shí)的MIC,計(jì)算出抑菌劑聯(lián)合的FIC指數(shù),FIC指數(shù)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為:FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用,0.52為拮抗作用。

FIC指數(shù)=MICA(聯(lián)合)/MICA(單用)+MICB(聯(lián)合)/MICB(單用)

1.2.4 靚果安與大蒜油以及復(fù)配液對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響 取活化到對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,調(diào)節(jié)菌懸液到106～107CFU/mL。每株菌懸液分別按照與靚果安MIC、大蒜油MIC以及復(fù)配液MIC體積比1∶50的比例加入,每種菌的每種處理測(cè)定時(shí)間24 h,在600 nm下每隔2 h測(cè)定OD值,以靚果安MIC、大蒜油MIC以及復(fù)配液MIC 空白調(diào)零并記錄吸光值[18]。

1.2.5 光學(xué)顯微鏡的觀察

1.2.5.1 樣品的前處理 挑取少量對(duì)數(shù)期的細(xì)菌菌落于無(wú)菌生理鹽水中,振蕩幾分鐘,利用分光光度計(jì)測(cè)量其吸光值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線用生理鹽水調(diào)整其濃度至1.5×108～3.0×108CFU/mL,用移液槍移取1 mL的菌懸液于99 mL的LB肉湯中,得到1.5×106～3.0×106CFU/mL的菌懸液肉湯。將濃度為MIC的三種抑菌劑(靚果安、大蒜油、復(fù)配液)分別添加入制備好的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌肉湯菌懸液中,搖勻后在37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.5.2 光學(xué)顯微鏡觀察 菌體革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察[16],以未經(jīng)抑菌劑處理的為空白組,進(jìn)行對(duì)比,觀察結(jié)構(gòu)的差異性。

1.2.6 透射電子顯微鏡的觀察

1.2.6.1 樣品的前處理 分別在制備好的濃度為106～107CFU/mL的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液中加入濃度為 MIC 的三種抑菌劑(靚果安、大蒜油、復(fù)配液),分別搖勻后在37 ℃培養(yǎng)24 h,離心(2500 r/min,15 min,4 ℃)后去上清液,PBS 緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.4)漂洗三次,菌體于3%的戊二醛固定液中,低溫下固定,備用[19]。

1.2.6.2 透射電子顯微鏡觀察 使用PBS緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.4)沖洗3次,每次15 min。再用1%鋨酸固定2 h,PBS沖洗3次,經(jīng)一系列乙醇(體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%)逐級(jí)脫水,然后用現(xiàn)配的90%丙酮和無(wú)水丙酮分別洗脫1～3次,每次15 min。環(huán)氧丙烷和環(huán)氧樹脂1∶1混合后作為浸透劑浸透樣品1 h后用純環(huán)氧樹脂包埋,于 37、45 ℃下分別聚合 24 h,最后入 60 ℃溫箱過夜。待樣品塊凝固后修塊,經(jīng)鈾、鉛雙染后,JEM-1230型投射電鏡下觀察、拍照,每個(gè)樣本重復(fù)取兩個(gè)平行進(jìn)行觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

全文的圖用Origin 8制作,數(shù)據(jù)采用SPSS 19進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度的測(cè)定

2.1.1 靚果安抑菌劑MIC的測(cè)定 由表1可知,對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與空白組,空白組生長(zhǎng)菌落總數(shù)增多,可知靚果安對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用;金黃色葡萄球菌從20 mg/mL開始平板中的菌落總數(shù)為0,可知靚果安對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)為20 mg/mL;大腸桿菌在40 mg/mL開始平板中的菌落總數(shù)為0,可知靚果安對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為40 mg/mL。

表1 靚果安對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株最低抑菌濃度(MIC)Table 1 The minimum inhibitory concentration of Liangguoan to the test strains

表5 復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果Table 5 Antibacterial effect of compound solution on Escherichia coli

2.1.2 大蒜油抑菌劑MIC的測(cè)定 由表2可知,對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與空白組,空白組生長(zhǎng)菌落總數(shù)明顯較多,可知大蒜油對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用;從0.4 mg/mL開始平板中的菌落總數(shù)為零,可知大蒜油對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度(MIC)為0.4 mg/mL。

表2 大蒜油對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)Table 2 Minimum inhibitory concentration of garlic oil against Staphylococcus aureus

由表3可知,對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與空白組,空白組生長(zhǎng)菌落總數(shù)明顯增多,可知大蒜油對(duì)大腸桿菌具有抑制作用。從51.2 mg/mL開始平板中的菌落總數(shù)為零,大蒜油對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為51.2 mg/mL。

表3 大蒜油對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)Table 3 Minimum inhibitory concentration of garlic oil on Escherichia coli

實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下靚果安對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果相當(dāng),大蒜油對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制能力較強(qiáng),對(duì)大腸桿菌的抑制效果較差。

2.1.3 復(fù)配液部分抑菌濃度指數(shù)

2.1.3.1 復(fù)配液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果 由表4可知,靚果安和大蒜油聯(lián)合使用后,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果增強(qiáng)。靚果安與大蒜油復(fù)配之后對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為:MICA(聯(lián)合)為0.3125 mg/mL,MICB(聯(lián)合)為0.00625 mg/mL,可得FIC(金黃色葡萄球菌)為0.03125,表現(xiàn)出協(xié)同作用。復(fù)配時(shí)靚果安和大蒜油的質(zhì)量比為0.3125∶0.00625,,即50∶1,所以本次實(shí)驗(yàn)采用靚果安和大蒜油的比例為50∶1作為最佳配比。

表4 復(fù)配液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of compound solution on Staphylococcus aureus

2.1.3.2 復(fù)配液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果 由表5可知,靚果安和大蒜油聯(lián)合使用后,對(duì)大腸桿菌的抑菌效果增強(qiáng)。靚果安與大蒜油復(fù)配之后對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度分別為:MICA(聯(lián)合)為10 mg/mL,MICB(聯(lián)合)為3.2 mg/mL,計(jì)算可得FIC(大腸桿菌)為0.3125,表現(xiàn)出協(xié)同作用。復(fù)配時(shí)靚果安和大蒜油的質(zhì)量比為10∶3.2,約為3∶1,所以本次實(shí)驗(yàn)采用靚果安和大蒜油的比例為3∶1作為最佳配比。

2.2 靚果安與大蒜油以及復(fù)配液對(duì)菌體生長(zhǎng)曲線的影響

圖1為靚果安與大蒜油以及復(fù)配液對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響。由圖1所示,隨著時(shí)間的增加,實(shí)驗(yàn)組與空白組OD值均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在0～8 h中,上升趨勢(shì)快速,其中金黃色葡萄球菌空白處理組上升幅度最大,結(jié)果表明,三種不同配方的抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)具有抑制作用。8～18 h中,菌體數(shù)量隨著時(shí)間的增加而增加,產(chǎn)生一定的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制,導(dǎo)致菌體數(shù)量上升不幅度減小,故此,菌體OD值上升幅度緩慢的下降,在18～24 h中,菌體數(shù)量趨于平穩(wěn),在有限的培養(yǎng)條件下,菌體生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)越來越激烈,數(shù)量就會(huì)慢慢趨于穩(wěn)定。

圖1 金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Staphylococcus aureus

復(fù)配液處理組比靚果安單獨(dú)使用的抑菌效果好,大蒜油單獨(dú)使用比復(fù)配抑菌劑的抑菌效果略好一點(diǎn),藥效相差區(qū)別不大,靚果安復(fù)配大蒜油中的大蒜油的用量卻比大蒜油單獨(dú)使用的量減少了很多,有明顯的農(nóng)藥減量化,表明靚果安復(fù)配大蒜油這種抑菌劑具有很好的實(shí)用價(jià)值。

如圖2隨著時(shí)間增加,大腸桿菌菌體數(shù)量也在增加。這與金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)的趨勢(shì)相似的,整體都是一開始幅度增加比較大然后幅度變小,到最后趨于平緩,產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因與金黃色葡萄球菌也是相似的。并且大腸桿菌空白組的菌體數(shù)量始終都比其他三個(gè)處理的菌體數(shù)量多,表明這些抑菌劑對(duì)大腸桿菌有抑制作用,靚果安復(fù)配大蒜油的抑菌能力比單獨(dú)使用靚果安或者單獨(dú)使用大蒜油好。

圖2 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of E. coli

2.3 光學(xué)顯微鏡觀察

將每組處理的菌體采用革蘭氏染色在光學(xué)顯微鏡里進(jìn)行觀察菌體形態(tài)。如圖3所示,金黃色葡萄球菌空白組中的菌體成串連接并且連接緊密,菌體呈圓形或者橢圓形,實(shí)驗(yàn)處理組菌體分散,不成串連接,菌體體積明顯小于空白組,且形狀發(fā)生改變,不是完整的圓形或橢圓形,在菌體周圍有細(xì)小的殘?bào)w,其中復(fù)配抑菌劑組菌體更為散亂,體積更小。

圖3 光學(xué)顯微鏡下金黃色葡萄球菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(×1000)Fig.3 Cell morphology of Staphylococcus aureusunder light microscopy(×1000)注:a:空白對(duì)照;b:靚果安;c:大蒜油;d:復(fù)配液;圖4同。

如圖4所示,大腸桿菌空白組中的菌體呈長(zhǎng)桿狀,形狀完整,實(shí)驗(yàn)處理組的菌體明顯變短,體積變小,且更為散亂,在菌體周圍形成細(xì)小的殘?bào)w。

圖4 光學(xué)顯微鏡下大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(×1000)Fig.4 Morphological structure of E. colicells under light microscope(×1000)

2.4 透射電子顯微鏡的觀察

將每組處理好的菌體放置于JEM-1230型TEM下觀察、拍照,每個(gè)樣本重復(fù)取兩個(gè)平行進(jìn)行觀察,見圖5。

圖5 透射電子顯微鏡下金黃色葡萄球菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.5 Morphological structure of Staphylococcus aureusunder transmission electron microscope注:a:空白對(duì)照,×50000;b:靚果安,×20000;c:大蒜油,×20000;d:復(fù)配液,×20000;圖6同。

如圖5a所示,正常的金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜完整,呈現(xiàn)圓形,形態(tài)飽滿,細(xì)胞之間的間隙清晰,沒有出現(xiàn)細(xì)胞破裂和內(nèi)容物外泄現(xiàn)象,細(xì)胞正常生長(zhǎng)分裂。如圖5b所示,靚果安作用下的金黃色葡萄球菌體積較空白組有所變小,小部分細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生破裂,內(nèi)容物流出,總體上形態(tài)仍是圓形。如圖5c所示,大蒜油作用下的金黃色葡萄球菌菌體形態(tài)發(fā)生異常,菌體欠飽滿,細(xì)胞表面出現(xiàn)破損,內(nèi)容物外泄,部分細(xì)胞膜質(zhì)分離嚴(yán)重。如圖5d所示,靚果安和大蒜油復(fù)配作用下的金黃色葡萄球菌菌體細(xì)胞膜破裂嚴(yán)重,大量細(xì)胞原生質(zhì)外泄,細(xì)胞與細(xì)胞之間的界限變得模糊,在細(xì)胞體周圍可見許多殘?bào)w。由此可見,抑菌強(qiáng)度為:復(fù)配液>大蒜油>靚果安,即復(fù)配組對(duì)金黃色葡萄球菌的破壞作用相比于單用靚果安或大蒜油更強(qiáng)烈,這為靚果安和大蒜油協(xié)同抑制金黃色葡萄球菌提供了有益依據(jù)。

如圖6a所示,正常的大腸桿菌形態(tài)完好,細(xì)胞壁和細(xì)胞膜光滑平整且緊密相連,細(xì)胞質(zhì)均勻,呈現(xiàn)典型的短桿狀,菌體飽滿。如圖6b所示,靚果安作用下的大腸桿菌菌體表面粗糙,內(nèi)容物外泄,部分菌體質(zhì)壁分離現(xiàn)象嚴(yán)重,細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空洞,形態(tài)變得狹長(zhǎng)或出現(xiàn)斷裂,但整體上仍呈現(xiàn)桿狀。如圖6c所示,大蒜油作用下的大腸桿菌形態(tài)嚴(yán)重扭曲變形,菌體細(xì)胞大量碎裂,已失去大腸桿菌短桿狀的特征。如圖6d所示,靚果安和大蒜油復(fù)配作用下的大腸桿菌菌體已被嚴(yán)重破壞,無(wú)可見的完整細(xì)胞壁細(xì)胞膜,變成了大量碎片。由此可見,抑菌強(qiáng)度為:復(fù)配液>大蒜油>靚果安,即復(fù)配組對(duì)大腸桿菌的破壞作用相比于單用靚果安或大蒜油更強(qiáng)烈,這為靚果安和大蒜油協(xié)同抑制大腸桿菌提供了有益依據(jù)。

圖6 透射電子顯微鏡下大腸桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.6 Morphological structure of Escherichia coliunder transmission electron microscope

3 結(jié)論與討論

靚果安和大蒜油對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)都具有一定的抑制效果。靚果安和大蒜油的復(fù)配對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出協(xié)同作用,最佳配比為50∶1;靚果安和大蒜油的復(fù)配對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出相加作用,最佳配比為3∶1。經(jīng)復(fù)配劑處理的金黃色葡萄菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)曲線均出現(xiàn)變化,表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢。光學(xué)顯微鏡分析表明,靚果安和大蒜油處理后的菌體分散,其中復(fù)配抑菌劑的菌體更為散亂,實(shí)驗(yàn)組的菌體形狀均發(fā)生改變,外形縮小,細(xì)胞裂解。透射電鏡分析表明,實(shí)驗(yàn)組的菌體發(fā)生嚴(yán)重異變,細(xì)胞脫落溶解,其抑菌機(jī)理可能在于破壞菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,致使細(xì)胞死亡[20-23]。