沈明明,賈明輝,謝澤晨,李安祺,韓紅麗,王 恬,張莉莉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

氧化還原狀態(tài)的平衡是肉雞機體健康發(fā)育的基礎(chǔ),在正常生理條件下,機體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可以維持活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)產(chǎn)生和消除的平衡。然而,現(xiàn)代肉雞生產(chǎn)中存在許多應(yīng)激因素,如免疫應(yīng)激、熱應(yīng)激、運輸應(yīng)激等,這些都會導(dǎo)致機體氧化還原狀態(tài)失衡[1]。肉雞機體抗氧化系統(tǒng)無法消除過量的ROS或RNS,導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)受損,引起脂質(zhì)過氧化物丙二醛產(chǎn)生,進一步造成組織損傷,肉品質(zhì)變差,生長發(fā)育受阻等等[2]。此外,雞肉中不飽和脂肪酸較高,相比其他肉產(chǎn)品更容易受到氧化,因而現(xiàn)代畜牧生產(chǎn)中基礎(chǔ)日糧中添加天然或合成的抗氧化劑來提高機體抗氧化能力。然而,消費者對動物食品中使用合成抗氧化劑的安全性提出了質(zhì)疑。因此,飼料添加天然植物提取物來提高動物機體抗氧化能力,以期改善肉雞健康并為人類提供安全放心肉產(chǎn)品在現(xiàn)代肉雞生產(chǎn)中引起了極大的關(guān)注。

竹子廣泛分布于世界各地,竹葉在我國有悠久的藥用和食用歷史,是一味著名的清熱解毒藥。竹葉成分復(fù)雜,隨著研究的深入,科研工作者在竹葉成分的提取與工藝優(yōu)化方面取得一定的進展[3-5]。張英[6]結(jié)合竹葉中黃酮類化合物存在的特點,開發(fā)出富含黃酮、多酚和多糖等生物活性成分的竹葉提取物(Bamboo leaf extract,BLE)。近些年,人們在竹葉提取物的生物學(xué)功能方面做了大量研究。王媛媛等[7]和倪向梅等[8]研究報道竹葉提取物具有優(yōu)良的抗菌、抑菌活性,在低濃度下仍然有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌增殖。此外,竹葉提取物還具有優(yōu)良的抗氧化功能。體外試驗表明,竹葉提取物可有效清除自由基,減少低密度脂蛋白氧化,抑制過渡態(tài)金屬離子和自由基誘導(dǎo)的高聚物的惡化[9]。同樣有研究報道竹葉提取物對超氧陰離子自由基、羥自由基和有機自由基均有超強的清除作用,可作為天然抗氧化劑開發(fā)利用[10-12]。體內(nèi)研究表明竹葉提取物可提高機體抗氧化酶表達,減少脂質(zhì)過氧化,緩解乙醇誘導(dǎo)的急性胃粘膜損傷[13]。此外,竹葉提取物可提高肝糖原含量,降低天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性和丙二醛含量,降低CCl4誘導(dǎo)的肝損傷作用[14]。竹葉提取物同時具有防腐、降脂、抗衰老作用,目前竹葉提取物已被廣泛利用到保健品、藥品和化妝品等領(lǐng)域,但關(guān)于竹葉提取物在畜牧生產(chǎn)中的研究比較少,而竹葉提取物作為食品添加劑在體內(nèi)抗氧化機理更未見報道,因此,本研究以白羽肉雞為動物模型,在日糧中添加竹葉提取物,研究其作為食品添加劑對機體健康狀態(tài)及抗氧化能力的影響,為竹葉提取物作為抗氧化劑在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

愛拔益佳(Arbor Acres,AA)肉雞,1日齡,雄性,256只 安徽和威集團;竹葉提取物(Bamboo leaf extract) 有效成分:總黃酮含量70 mg/g,總多酚含量50.42 mg/g,浙江新篁生物技術(shù)有限公司;總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine transaminase,ALT)、總蛋白(Total protein,TP)、血糖(Glucose,GLU)、尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)試劑盒 上?？迫A生物工程有限公司;總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA) 南京建成生物工程研究所。

Model PRO 200 double insulated勻漿機 美國Pro-Science公司;VITALAB Selecta E 全自動生化分析儀 荷蘭MERK公司;B10-RAD680酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與日糧配方設(shè)計 試驗設(shè)計采用隨機單因子實驗,選擇體重相近、1日齡的AA雄性肉雞256只,隨機分為4組,每組8個重復(fù),每個重復(fù)8只雞。試驗周期為21 d。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧,樣品組在每千克基礎(chǔ)日糧中分別添加0.10%、0.20%和0.40% 竹葉提取物。試驗基礎(chǔ)日糧配方參照NRC1994《家禽的營養(yǎng)需要量》,日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧配方及營養(yǎng)成分表Table 1 Basic diet formula and nutrient composition list

1.2.2 飼養(yǎng)管理 試驗雞在室內(nèi)同一飼養(yǎng)管理條件下進行,采用3層疊籠飼養(yǎng)。試驗前對育雛舍及器具進行消毒。每日喂料2次,持續(xù)光照,試驗期內(nèi)自由采食和飲水。飲水器與料槽每日清洗1次,肉雞免疫接種與雞舍消毒均按常規(guī)進行。

1.2.3 樣品采集 試驗第21 d每個重復(fù)取1只肉雞(體重接近該重復(fù)平均體重)頸靜脈采血,4 ℃、3500 r/min離心10 min制備血清,血清置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。肉雞放血致死后剖開腹腔,取肝臟和胸肌組織于凍存管中保存在液氮中備用。

1.2.4 指標測定

1.2.4.1 血清生化測定 取保存于-20 ℃的血清,4 ℃解融后利用全自動生化分析儀測定TC、TG、TP、GLU、BUN含量和AST、ALT活力。

1.2.4.2 抗氧化指標測定 取保存于液氮中的肝臟組織0.5 g加入4.5 mL 0.9%生理鹽水在冰水浴條件下利用勻漿,制備20%組織勻漿液(肌肉勻漿液制備同肝臟);隨后勻漿液在4000 r/min條件下離心10 min,取上清液,迅速保存在-20 ℃。主要測定血清、肝臟和肌肉中MDA和GSH含量,測定血清、肝臟和肌肉中T-SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性,以及T-AOC活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用完全隨機化設(shè)計,以重復(fù)為實驗單位。所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2016進行初步處理,采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行顯著性檢驗,LSD進行多重比較,以P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著判斷標準,數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹葉提取物對肉雞早期血液生化的影響

丁紅秀等[15]和付彥君等[16]研究證實竹葉提取物可降低高脂血癥小鼠血清膽固醇水平。大量研究證實植物源性黃酮、多酚類物質(zhì)具有降脂和降膽固醇作用,例如染料木黃酮[17]和山楂葉黃酮[18]均可以改善肉雞脂代謝和膽固醇代謝來降低血清TC 和TG 含量。由表2可知,與對照組相比,添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物對肉雞前期血清中TC 含量分別降低了3.28%、17.01%和9.55%,其中0.2% 竹葉提取物組顯著低于對照組(P<0.05)。本研究結(jié)果表明,添加竹葉提取物顯著降低了肉雞血清TC 含量,TG 有降低的趨勢;這可能是竹葉黃酮發(fā)揮著作用。

表2 竹葉提取物對肉雞早期血液生化的影響Table 2 Effects of bamboo leaf extract on early blood biochemistry in broiler chickens at early age

家禽代謝中一項重要指標是BUN,可以反映機體蛋白質(zhì)代謝和氨基酸之間的平衡狀況,同樣側(cè)面反映機體腎臟、膀胱的健康狀態(tài)。由表2可知,添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物可顯著降低肉雞前期血清中BUN含量,分別降低33.33%、37.68%和46.38%(P<0.05),0.4% 組極顯著低于對照組(P<0.01)。吳紅燕等[19]報道在蛋雛雞日糧中添加竹葉黃酮可顯著降低雛雞血清BUN 和尿酸含量,說明竹葉黃酮對腎臟排除代謝廢物具有一定的促進作用。由表2可知,添加竹葉提取物對肉雞前期血清TG、ALT、AST、TP和GLU 無顯著影響(P>0.05),0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物對ALT有降低的趨勢,分別降低4.73%、11.89%和28.11%;對TP 有升高的趨勢,0.20%和0.40%添加組分別提高6.47%和8.30%。肝臟損傷時,血液中AST 和ALT 會急劇升高。張師等[20]研究表明竹葉提取物可以顯著緩解肝損傷引起的小鼠血清AST 和ALT 活性的升高,本研究中,添加竹葉提取物對血清中AST 和ALT 有降低的趨勢,可見竹葉提取物對肝臟具有一定的保護作用。基于以上結(jié)果可知,日糧添加竹葉提取物可提高肉雞對體內(nèi)氨基酸和氨的合成利用率,進而促進體蛋白合成,在一定程度上改善機體氨基酸代謝。

2.2 竹葉提取物對肉雞早期機體抗氧化能力的影響

在動物機體細胞中,ROS不斷地通過酶促反應(yīng)和非酶促反應(yīng)產(chǎn)生,每日約有1%～3%的攝入氧被轉(zhuǎn)化為超氧陰離子及其衍生物[21]。ROS會對動物機體細胞內(nèi)幾乎所有的大分子物質(zhì)如DNA、蛋白質(zhì)和脂類等的結(jié)構(gòu)和功能造成損傷并且引起一系列的氧化應(yīng)激疾病。正常生理條件下,動物機體內(nèi)的ROS水平會被維持在極低的無害水平,然而現(xiàn)代集約化畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)激因子往往使機體產(chǎn)生大量的自由基,導(dǎo)致機體氧化還原狀態(tài)失衡,進一步引發(fā)各種生理疾病。

T-AOC是衡量機體或組織整體抗氧化能力的指標,反映體內(nèi)氧化物和抗氧化物質(zhì)的平衡狀態(tài)。由表3～表5可知,竹葉提取物對肉雞早期肌肉和肝臟T-AOC無顯著影響,但0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物組血清T-AOC分別提高了10.28%、13.83%和4.08%,基于此結(jié)果推測添加竹葉提取物對肉雞整體抗氧化狀態(tài)有一個相對的提高。

表3 竹葉提取物對肉雞早期胸肌抗氧化能力影響Table 3 Effects of bamboo leaf extract on antioxidant capacity of breast meat in broiler chickens at early age

表5 竹葉提取物對肉雞早期血清抗氧化能力的影響Table 5 Effect of bamboo leaf extract on serum antioxidant capacity in broiler chickens at early age

CAT、SOD和GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化物酶。CAT可以催化過氧化氫分解,減少體內(nèi)羥自由基的產(chǎn)生;GSH-Px可以清除細胞代謝過程中脂質(zhì)過氧化物和羥自由基,可減少細胞膜多不飽和脂肪酸的過氧化作用[22]。SOD是細胞內(nèi)重要的超氧離子清除酶,對于維持細胞結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。據(jù)報道竹葉提取物具有類SOD活性[23],日糧添加竹葉提取物使肉雞前期胸肌、肝臟和血清SOD有升高的趨勢。由表3～表5可知,添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物對胸肌和血清中SOD分別提高11.01%、14.18%、14.05%和8.55%、4.39%、13.11%;此外,0.10%和0.20% 組對肝臟SOD活性提高3.46%、8.20%。同時,竹葉提取物對肝臟和血清GSH-Px 活性具有一定的提升作用,由表4和表5可知,與對照組相比,0.10%和0.20% 竹葉提取物組對肉雞肝臟和血清中GSH-Px活性分別提高5.96%、2.81%和5.82%、4.90%;其中0.10%竹葉提取物組血清GSH-Px顯著高于對照組(P<0.05)。章榮華等[24]研究表明竹葉提取物可顯著提高老齡大鼠血清中SOD和GSH-Px酶活性,可提高機體抗氧化功能,邵瑩等[25]研究證實心肌缺血-再灌注損傷小鼠補充竹葉提取物后,血清SOD和GSH-Px酶活性顯著提高(P<0.05),可見竹葉提取物可通過提高機體抗氧化能力達到抗炎作用。關(guān)于竹葉提取物對肉雞抗氧化物酶活性影響的研究目前尚未報道,但大量研究表明天然植物提取物,如金盞菊提取物[26]、銀杏葉提取物[27]和青蒿素[28]等具有抗氧化活性的物質(zhì)均可以提高肉雞機體SOD、GSH-Px酶活性,而本研究中日糧添加竹葉提取物并未對抗氧化酶活性產(chǎn)生顯著影響,這可能是由于試驗前期肉雞采食量少而使得攝入體內(nèi)的竹葉提取物少導(dǎo)致的,但血清總抗氧化能力提高,說明竹葉提取物可能改善非抗氧化酶系統(tǒng)。

表4 竹葉提取物對肉雞早期肝臟抗氧化能力的影響Table 4 Effects of bamboo leaf extract on antioxidant capacity of liver in broiler chickens at early age

GSH 是體內(nèi)重要的非酶類抗氧化物質(zhì),與SOD、CAT 和GSH-Px 等共同維持機體氧化還原狀態(tài)。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一,常用來衡量機體或組織氧化應(yīng)激程度。由表3和表4可知,與對照組相比,添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物可提高胸肌和肝臟GSH 含量,分別提高13.08%、31.22%、20.25%和1.48%、38.52%、62.22%;其中0.20%和0.40% 組肝臟GSH 含量顯著高于對照組(P<0.05),本研究結(jié)果說明竹葉提取物促進非抗氧化酶物質(zhì)合成。Elisabeth等[29]闡明許多親電子復(fù)合物包括多酚類和植物衍生類成分是Nrf2-Keap1 信號通路的觸發(fā)因子;同樣有研究證實肉雞日糧中添加植物提取物可以激活Nrf2 信號通路來促進GSH 的合成與再生[30-31],本研究中GSH 含量有所提高可能與竹葉提取物激活該通路有關(guān)。此外,由表4和表5可知,日糧添加0.10%、0.20%和0.40%竹葉提取物使肉雞早期肝臟和血清MDA 含量分別降低11.11%、10.10%、7.07%和11.18%、14.59%和4.05%。Gong等[32]等在體外研究中證實竹葉提取物對自由基具有較強的清除作用,同樣有研究報道,竹葉提取物可降低心肌缺血-再灌注損傷大鼠血清MDA 含量[33]。除此之外,據(jù)報道日糧添加黃酮類或多酚植物提取物可能通過增強供氫能力來提高肉雞自由基清除能力,降低脂質(zhì)氧化[34],同時,多酚類可有效抑制硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)的形成[35]。因此,結(jié)合本研究結(jié)果推測,竹葉提取物降低機體MDA 含量可能是竹葉黃酮和多酚作用的結(jié)果。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)肉雞早期日糧中添加一定劑量竹葉提取物可以通過提高機體抗氧化物酶的表達和非酶類抗氧化物的生成來提高抗氧化能力,同時清除機體自由基減少脂質(zhì)過氧化物的生成來緩解氧化應(yīng)激,在一定程度上改善肉體機體健康狀態(tài),進而改善雞肉品質(zhì),可作為食品抗氧化劑使用,研究成果為竹葉提取物作為抗氧化劑在食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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