王夢雅,趙喆禛,薛 嬌,胡錦榮,張京生,劉 萍

(中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院,北京 100083)

樺褐孔菌(Inonotusobliquus),屬于擔子菌亞門,層菌綱,多孔菌目,多孔菌科木腐真菌,同時也是一種珍貴的白腐真菌[1]。主要生長繁殖在白樺樹、榆樹等樹皮腋下,主要分布在北緯45°～50 °,包括中國的黑龍江、小興安嶺、長白山、日本的北海道以及西歐等地區(qū)[2-4]。16～17世紀以來,在俄羅斯和西伯利亞西部,這種真菌早已被用于民間醫(yī)學治療癌癥[5-7],通過樺褐孔菌輸液治療來治療牙周炎、濕疹、皮炎和牛皮蘚,樺褐孔菌粉末用來治療化膿性傷口[8-10]。此外,在烏克蘭、白俄羅斯、波蘭和大多數(shù)波羅的海國家,民間醫(yī)學早有用樺褐孔菌來治療腸道癌、心血管疾病和糖尿病的記錄[11]。距今為止,從樺褐孔菌中分離出來的化學物質有:三萜類化合物、黑色素、類固醇、多糖等,均顯示出一定的生物學活性[12-13]。目前,在樺褐孔菌液體深層發(fā)酵過程中,研究較多的活性成分為多糖和三萜類化合物。

樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌中最主要的化學成分,但是由于其分離、純化的難度較高,因此多報道的是粗多糖的含量,目前樺褐孔菌多糖的分離純化一般通過DEAE-52離子交換柱層析、和Sephadex G-200柱層析等方法進行分離純化,探究純化多糖的降血糖活性對深入研究多糖降血糖機理有著重要意義。肝細胞是糖代謝作用的靶細胞之一,HepG2細胞是肝癌細胞的一種,形態(tài)、功能均類似于人體干細胞[14],可以利用此細胞來研究樺褐孔菌粗多糖的體外降血糖活性。此外,胰島素抵抗(insulin resisitance,IR)是Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的重要發(fā)病機制之一,胰島抵抗現(xiàn)象一直存在于T2DM發(fā)展的整個過程[15-16]。HepG2細胞經(jīng)誘導劑的刺激可使得表面胰島素受體數(shù)目減少,從而使細胞呈現(xiàn)胰島素抵抗狀態(tài)[17],通過高糖高胰島素法誘導建立HepG2細胞胰島素抵抗模型,是體外研究功能活性成分改善胰島素抵抗作用的良好實驗模型。

本實驗室前期分離純化了四種子實體純化多糖,發(fā)現(xiàn)4種純化多糖均能促進HepG2細胞對葡萄糖的消耗[18-19],效果與二甲雙胍和胰島素相近,顯著高于對照組,為進一步驗證純化多糖的活性,本文通過樺褐孔菌菌絲體液體深層發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖,并通過DEAE-52離子交換柱進行初步純化,選用HepG2細胞來研究樺褐孔菌多糖的體外降血糖活性,為進一步純化多糖生產(chǎn)藥物提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

HepG2肝癌細胞株 北京博奧森生物公司;DMEM培養(yǎng)、胰蛋白酶消化液 北京科奧試劑有限公司;胎牛血清(FBS) 杭州四季青生物工程材料有限公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)、胰島素 美國Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO) 天津市富宇精細化工有限公司;鹽酸二甲雙胍(Met) 北京中惠藥業(yè)有限公司;葡萄糖測定試劑盒 南京建成生物科技股份有限公司;磷酸緩沖液(PBS)、青霉素-鏈霉素雙抗 北京索萊寶科技有限公司;阿卡波糖 上海源葉公司。

SW-CJ-2D超凈工作臺、YCP-50CO2培養(yǎng)箱 北京三木科技儀器有限公司;TG16-WS臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;YXQ-SG41-280滅菌鍋 四川射洪醫(yī)療器械廠;M200 pro多功能酶標儀 Tecan集團奧地利有限公司;細胞培養(yǎng)瓶 北京均利博科技有限公司;96孔細胞培養(yǎng)板 美國康寧公司;0.22 μm微孔濾膜 北京均利博科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的分離純化 添加4 μg/mL VB6于發(fā)酵培養(yǎng)基中,發(fā)酵、濃縮、醇沉得到粗多糖。

1.2.1.1 種子培養(yǎng) 培養(yǎng)基:葡萄糖2%,胰蛋白胨0.4%,KH2PO40.1%,MgSO40.1%,pH自然。將樺褐孔菌PDA斜面菌種接入250 mL搖瓶,裝液量100 mL,于28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d,獲得一級搖瓶種子。

1.2.1.2 發(fā)酵培養(yǎng) 同種子培養(yǎng)基成分。將長好的種子培養(yǎng)基以10%的接種量接入250 mL的錐形瓶中,添加4 μg/mL VB6于發(fā)酵培養(yǎng)基中,裝液量100 mL,于28 ℃ 150 r/min振蕩培養(yǎng)13 d。

1.2.1.3 粗多糖的分離 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)13 d后,抽濾獲得發(fā)酵液,在40～65 ℃的條件下濃縮發(fā)酵液至10 mL,添加4倍體積的無水乙醇醇沉、過夜、烘干后即得到發(fā)酵粗多糖。

1.2.1.4 多糖純化 采用Xue等[19]的方法并加以改進,DEAE-52纖維素為預溶脹型陰離子交換樹脂。先將DEAE-52陰離子交換劑干粉浸泡于蒸餾水中約5 h,去除雜質;而后用0.5 mol/L的HCl溶液中浸泡1～2 h,用去離子水洗至pH為中性,抽濾、干燥后繼續(xù)浸泡在0.5 mol/L的NaOH溶液中1～2 h,抽干后即得到處理好的DEAE-52纖維素。取干燥潔凈的層析柱,豎直固定,然后加入1/3體積的蒸餾水,打開下端出口,排出氣泡。沿內(nèi)壁將預處理的DEAE-52纖維素緩慢倒入層析柱中,用平衡緩沖液平衡,直至流出液體的pH與緩沖液一致,待柱面高度不再變化準備上樣。然后用去離子水、0.5 mol/L NaCl溶液對DEAE進行多糖溶液洗脫,得到的兩種多糖洗脫液,洗脫峰單一,說明兩種多糖均為純多糖。將多糖洗脫液濃縮得到水洗多糖液和0.5 mol/L NaCl洗脫多糖液。將多糖洗脫液過0.45 μm濾膜,凍干后即得兩種純化多糖,記為EIOP1(ExtracellularInonotusobliquuspolysaccharides 1,水洗多糖)、EIOP2(0.5 mol/L NaCl洗脫多糖)。針對兩種多糖,采用葡萄糖凝膠滲透色譜(GPC)進一步驗證多糖的純度。實驗結果表明,EIOP1和EIOP2組分經(jīng)過GPC分離后都只得到一個單峰,從而說明這兩種多糖分布均勻,不含其他雜質,這與本實驗室前期研究結果[20]一致,且兩種純化多糖的分子量分別為20240、202869 Da。

1.2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性分析 用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(PBS)稀釋得到不同濃度粗多糖溶液,按表1加入各反應試劑。首先,加入濃度為10、20、40、80、160和320 μg/mL多糖樣品溶液,在37 ℃下保持5 min,然后向反應體系中加入α-葡萄糖苷酶,在37 ℃下反應30 min,隨后加入底物pNPG(對硝苯基-B-D-吡喃半乳糖苷)引發(fā)反應,繼續(xù)在37 ℃下反應30 min。最后,向反應體系中加入Na2CO3終止反應,在405 nm處測量吸光度[21]。樣品對照組用PBS代替α-葡萄糖苷酶,通過公式計算α-葡糖苷酶的抑制率(R),并用Origin 8.0計算IC50值。

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制率反應體系Table 1 Reaction system of inhibition activity against α-glucosidase

1.2.3 樺褐孔菌菌絲體多糖的HepG2細胞實驗

1.2.3.1 HepG2細胞的復蘇與培養(yǎng) 復蘇HepG2細胞:從液氮罐中取出細胞冷凍管,迅速將其放入37 ℃水浴鍋中,使細胞緩慢解凍。將細胞吸取至無菌細胞培養(yǎng)瓶中,加入含有5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃下,于5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,直至大多數(shù)貼壁細胞能夠存活并增殖。

傳代培養(yǎng)HepG2細胞:將舊培養(yǎng)基吸棄,加入600 μL胰蛋白酶,消化結束后,迅速棄去胰蛋白酶,加入含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基,反復輕輕吹打培養(yǎng)瓶壁,使所有細胞脫離瓶壁,經(jīng)吹打后得到的細胞懸液以1∶3 (V/V)接種到新的培養(yǎng)瓶中,在5% CO2、95% O2、37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.2.3.2 不同刺激因子發(fā)酵胞外多糖對HepG2細胞增殖的作用 用胰蛋白酶溶液消化1.2.3.1中復蘇后的細胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液吹打均勻,通過細胞計數(shù),使單細胞懸液密度為1×106cell/mL,移液槍高壓滅菌后吸取100 μL/孔接種。加入終濃度為10、20、40、80、160 μg/mL的多糖樣品組,設置不加藥物的對照組,此外,設置二甲雙胍組(Met,終濃度為1×10-3mmol/L),分別孵育24、48 h后,于5% CO2、95% O2、37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后,每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液,于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵化4 h。吸棄舊培養(yǎng)基,加入二甲亞砜(DMSO)150 μL,用槍頭吹吸均勻,結晶物充分溶解后,在570或490 nm處測定96孔板吸光值,通過吸光值的數(shù)值計算出活性細胞數(shù)量[22]。

1.2.3.3 不同刺激因子發(fā)酵胞外多糖對正常HepG2細胞葡萄糖消耗的影響 濃度為10、20、40、80 μg/mL的多糖樣品對正常HepG2細胞葡萄糖消耗的影響參考文獻[23]進行。首先將活化好的細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,使每孔細胞密度為1×106cells/mL,以不含多糖樣品的DMEM培養(yǎng)液作為空白對照組,以終濃度為10、20、40、80 μg/mL的多糖樣品組為實驗組。此外,設置陽性對照組:二甲雙胍組(Met,終濃度為1×10-3mmol/L),孵育24 h后,按照試劑盒說明書的指示方法檢測葡萄糖含量。

細胞的葡萄糖消耗量(ΔGC)=空白組上清液葡萄糖含量-實驗組上清液葡萄糖含量。

為防止細胞增殖或死亡產(chǎn)生的誤差,每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h,培養(yǎng)結束后,每孔加入150 μL DMSO,振蕩10 min,于570 nm處測定吸光值,結果以ΔGC/MTT表示。

1.2.3.4 HepG2細胞胰島素抵抗模型的建立 建立胰島素抵抗模型的方式有多種,本實驗中采用高糖高胰島素法,并加以改進[24]。調整細胞密度為2×106cell/mL,此密度大于正常HepG2細胞組,有利于胰島素抵抗效果的檢測。待細胞貼壁后,加入新配制的含有胰島素的培養(yǎng)液,使其終濃度為10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L,并設無胰島素的空白孔為正常對照組,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用葡萄糖試劑盒檢測葡萄糖含量,以葡萄糖消耗量最低者為胰島素抵抗細胞模型的建立標準。

1.2.3.5 不同刺激因子發(fā)酵胞外多糖對胰島素抵抗(IR)-HepG2細胞葡萄糖消耗的影響 按照文獻[25]中記錄的方法進行實驗,并進行適當修改。以2×106cell/mL的密度鋪板,加入合適濃度的胰島素,使其達到誘導濃度(10-6mol/L),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h完成誘導,建立抵抗模型。隨后,以加入濃度為10、20、40、80 μg/mL的多糖樣品組為實驗組,設置不加胰島素組為空白對照組,二甲雙胍組為陽性對照組,不加多糖樣品IR組為陰性對照組。藥物處理24 h后,同1.2.3.3處理,結果以ΔGC/MTT表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3次,結果用平均值±標準差表示。采用Excel、SPSS 22.0、Origin 8.0統(tǒng)計分析軟件進行分析,多組間比較用ANOVA方差分析。

2 結果與分析

2.1 樺褐孔菌菌絲體純化多糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

阿卡波糖(Acarbose)是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑,通過抑制食物中碳水化合物分解為葡萄糖,從而緩解餐后高血糖,達到降血糖的作用,是一種治療糖尿病的藥物[26]。樺褐孔菌菌絲體純化多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性見表2。由表可知,EIOP1、EIOP2的IC50值分別為39.18、29.87 μg/mL,均極顯著低于阿卡波糖(P<0.01),IC50值為1020.89 μg/mL,顯示出較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性。此外,兩種純化多糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著高于未純化的粗多糖(P<0.05),說明經(jīng)過分離提純后的樺褐孔菌菌絲體純化多糖具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

表2 不同濃度純化多糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響Table 2 Effect of different concentrations of purifiedpolysaccharides on α-glucosidase inhibitory activity

2.2 不同濃度樺褐孔菌菌絲體純化多糖對HepG2細胞增殖的影響

不同濃度樺褐孔菌菌絲體純化多糖對HepG2細胞增殖的影響如表3所示,隨著多糖濃度的增大,細胞增殖率逐漸變小。將細胞分別培養(yǎng)24、48 h,當純化多糖濃度為10～80 μg/mL時,EIOP1、EIOP2對細胞活性影響不大,細胞增殖率大于90%,表明此濃度范圍內(nèi)的多糖溶液對HepG2細胞沒有生理毒性,而濃度為160 μg/mL時,EIOP1細胞增殖率小于90%,與對照相比有極顯著差異(P<0.01),說明濃度過高會給細胞產(chǎn)生一定的毒性影響,此外二甲雙胍組與對照組相比無顯著差異,說明此濃度(10-3mmol/L)的二甲雙胍對HepG2細胞的生理活性沒有影響。因此選擇樣品濃度為10、20、40和80 μg/mL為安全給藥范圍繼續(xù)后續(xù)研究。

表3 不同濃度純化多糖對HepG2細胞增殖作用的影響Table 3 Effects of purified polysaccharides at differentconcentrations on proliferation of HepG2 cells

2.3 HepG2細胞葡萄糖消耗情況

2.3.1 不同濃度胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響 由圖1所示,利用高糖高胰島素對HepG2細胞進行誘導,使其對胰島素產(chǎn)生抵抗,模擬Ⅱ型糖尿病細胞模型。由圖1可知,當胰島素濃度為10-6mol/L時,其葡萄糖消耗量最低,極顯著低于對照組與其他組(P<0.01),說明模型建立成功,因此,選用濃度為10-6mol/L胰島素誘導的HepG2細胞為胰島素抵抗型細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 不同濃度胰島素對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響Fig.1 Effect of different concentrations ofinsulin on glucose consumption in HepG2 cells 注:與對照組細胞相比,***表示P<0.01差異極顯著,*表示P<0.05差異顯著;與10-6 mol/L組相比,&&表示P<0.01差異極顯著,&表示P<0.05差異顯著。

2.3.2 樺褐孔菌菌絲體胞外純化多糖EIOP1對體外細胞降血糖活性的影響 樺褐孔菌菌絲體純化多糖EIOP1對正常HepG2細胞24 h的葡萄糖消耗的影響如圖2A所示,培養(yǎng)24 h后,與對照組相比,EIOP1在濃度為40～80 μg/mL時,均能促進HepG2細胞的葡萄糖消耗量,隨著樣品濃度的增加,其促進葡萄糖消耗率的趨勢逐漸升高后逐漸穩(wěn)定。當樣品組濃度為80 μg/mL時,促進效果最好,葡萄糖消耗量比對照組提高30.62%,具有極顯著差異(P<0.01)。

圖2 不同濃度EIOP1對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響Fig.2 Effect of different concentrations ofEIOP1 on glucose consumption in HepG2 cells注:A:HepG2細胞;B:IR-HepG2細胞;與對照組細胞相比,***P<0.01差異極顯著,*P<0.05差異顯著;與IR組相比,&&P<0.01差異極顯著,&P<0.05差異顯著;與二甲雙胍組相比,##P<0.01差異極顯著,#P<0.05差異顯著;圖3同。

樺褐孔菌菌絲體純化多糖EIOP1對IR-HepG2細胞24 h的葡萄糖消耗實驗如圖2B所示。,與IR組相比,多糖濃度在10～40 μg/mL時能夠極顯著促進胰島素抵抗細胞的葡萄糖消耗(P<0.01),其中樣品組濃度為40 μg/mL時,促進效果最好,比IR組提高了30.00%,接近于Met(二甲雙胍)組。隨著樣品濃度的增加,其促進葡萄糖消耗率的趨勢逐漸升高并達到最大,隨后下降,多糖濃度在80 μg/mL時其促進葡萄糖消耗量降低,接近IR組,可能是由于高濃度多糖溶液對IR-HepG2細胞產(chǎn)生了生理毒害作用[27],具體機制有待進一步研究。

2.3.3 樺褐孔菌菌絲體胞外純化多糖EIOP2對體外細胞降血糖活性的影響 樺褐孔菌菌絲體純化多糖EIOP2對正常HepG2細胞24 h的葡萄糖消耗實驗如圖3A所示。與對照組相比,EIOP2在10～80 μg/mL時都能提高HepG2細胞的葡萄糖消耗量。當樣品濃度在40 μg/mL時,極顯著促進了葡萄糖消耗(P<0.01),比對照組提高了75.99%。

胰島素抵抗是Ⅱ型糖尿病的重要的發(fā)生機制之一,改善胰島素的敏感性,增強胰島素調節(jié)血糖功能是降血糖重要機制之一[28]。樺褐孔菌菌絲體純化多糖EIOP2對IR-HepG2細胞24 h的葡萄糖消耗實驗如圖3B所示,與IR組相比,EIOP2在10～80 μg/mL時,能夠顯著促進細胞的葡萄糖消耗,具有極顯著差異(P<0.01),其中樣品組濃度為80 μg/mL時,促進效果最好,比IR組提高了90.49%(P<0.01),高于Met組,差異有極顯著性(P<0.01)。說明樺褐孔菌純化多糖能夠顯著提高胰島素抵抗型HepG2細胞的葡萄糖消耗能力,改善胰島素抵抗狀態(tài)[28]。

圖3 不同濃度EIOP2對HepG2細胞葡萄糖消耗的影響Fig.3 Effect of polysaccharides eluted with differentconcentrations of EIOP2 on glucose consumption in HepG2 cells

3 討論與結論

α-葡萄糖苷酶抑制劑因對④型糖尿病有治療作用而備受關注,它能減少進入腸胃中的食物中葡萄糖的釋放,從而降低餐后血糖,機理主要是抑制劑通過降低人體內(nèi)小腸內(nèi)絨毛膜的麥芽三糖、雙糖類水解酶以及結合酶的活力,從而降低血糖[29]。本文將發(fā)酵醇沉得到粗多糖過DEAE-52纖維素柱進行分離純化,探究了樺褐孔菌菌絲體發(fā)酵純化多糖體外降血糖活性,結果表明,EIOP1、EIOP2均能夠抑制α-葡萄糖苷酶活性,且IC50均顯著低于陽性對照臨床藥用阿卡波糖(P<0.01)和粗多糖(P<0.05)。

胰島素抵抗是多種代謝相關疾病的共同病理生理基礎及共有的危險因素,已成為Ⅱ型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié),因此可從防治及其糖脂代謝紊亂入手從中藥中尋找優(yōu)良的治療糖尿病新藥[30]。本文選用人源HepG2細胞,研究了樺褐孔菌多糖對正常HepG2細胞和IR-HepG細胞的葡萄糖消耗作用,實驗結果表明純化后的樺褐孔菌多糖能顯著促進高胰島素誘導的IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗,使IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗量明顯增加,其作用程度優(yōu)于二甲雙胍,說明樺褐孔菌純化多糖能夠改善的胰島素抵抗狀態(tài),增強細胞對葡萄糖的攝取和利用,這與龍凱等[29]和李長貴等[31]的研究結果相一致。高濃度(80 μg/mL)的EIOP1其促進IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗的效果降低,而相同濃度的EIOP2對促進葡萄糖消耗作用卻保持不變,推測原因可能是與其理化性質、單糖組成、分子量大小和結構特征等緊密相關[20]。實驗結果還表明,兩種樺褐孔菌多糖一定濃度范圍內(nèi)均能夠顯著促進HepG2和IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗,且不同濃度樺褐孔菌對促進葡萄糖消耗具有不同的效果,后續(xù)研究可以注重于探究樺褐孔菌多糖對糖代謝關鍵酶活性的影響。

綜上,純化后的兩種多糖其α-葡萄糖苷酶抑制活性顯著高于粗多糖,而促進體外細胞的葡萄糖消耗效果不等同于粗多糖,可能是因為樺褐孔菌粗多糖中多糖成分復雜,互相之間能起到協(xié)同作用,具體協(xié)同機制有待研究。