劉 穎,張曉琳,徐晨冉,王 佳,韓田露,李 聰,張 航

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150076)

大豆分離蛋白(Soy protein isolate,SPI)是一種蛋白質(zhì)含量在90%以上的重要植物蛋白,是具有吸油性、保水性、發(fā)泡性、乳化性、凝膠性等多種功能特性的常用食品基料[1-2]。大豆分離蛋白因其較高的營養(yǎng)價值、眾多的功能性質(zhì)和成本低廉的優(yōu)點,在食品加工領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[3]。蛋白質(zhì)的吸油性和保水性是肉制品、面包、蛋糕、冰淇淋等食品加工過程中兩項重要的特性和質(zhì)量控制指標(biāo)[4]。然而,在這些食品體系中,由于大豆分離蛋白的吸油、保水能力不理想而限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用,因而越來越多的研究集中在對天然大豆分離蛋白的改性,以期改善其吸油性、保水性[5]。常用的改性方法有物理、化學(xué)及酶改性法,其中酶法改性具有高效性、專一性、多樣性、溫和性和無副產(chǎn)物等優(yōu)點,對食物營養(yǎng)結(jié)構(gòu)也無破壞作用[6]。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase,TGase)是一種由331個氨基組成的具有活性中心的單體蛋白質(zhì),可以催化蛋白質(zhì)或多肽發(fā)生分子內(nèi)和分子間的共價交聯(lián),從而改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能[7-8],尤其對蛋白質(zhì)吸油性、保水性、發(fā)泡性、熱穩(wěn)定性和凝膠性能等改善效果顯著,進而改善食品的口感風(fēng)味、質(zhì)地外觀等,因此轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在食品加工業(yè)中的應(yīng)用頗受關(guān)注[9-10]。將酶水解與酶交聯(lián)的方法并用,可使大豆蛋白的某些功能特性有更大的提高。Babiker[11]研究了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化大豆蛋白酶解物的交聯(lián),其起泡性和乳化性有很大的提高,生成的聚合物更耐酸、耐熱。Walsh等[12]研究了大豆分離蛋白經(jīng)水解及TGase交聯(lián)作用對于蛋白質(zhì)溶解性的影響,研究表明交聯(lián)后大豆分離蛋白的溶解性有很大提高。

本實驗以大豆分離蛋白(SPI)為原料,通過木瓜蛋白酶酶解獲得其酶解物后,再利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TGase)對其酶解物進行交聯(lián)作用,在不同條件下研究TGase改性對大豆分離蛋白吸油及保水性的影響,采用響應(yīng)面試驗對交聯(lián)條件進行優(yōu)化,以期得到吸油性與保水性最優(yōu)的交聯(lián)條件,并對改性前后粒徑、Zeta電位、自由氨基含量等理化性質(zhì)與吸油性、保水性之間的相關(guān)性進行了探究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白 臨沂山松生物制品有限公司;木瓜蛋白酶(800 U/mg) 北京博奧拓達科技有限公司;轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(130 U/g) 江蘇一鳴生物股份有限公司;鄰苯二甲醛(OPA) 青島雅各化學(xué)試劑銷售有限公司。

BS224S型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;pHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠;SY-24型恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司;202型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TG16-WS型臺式高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;XHF-DY型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司;722S型分光光度計 上海光譜儀器有限公司;Malvern激光粒度儀 上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白酶解物的制備 取一定量SPI于燒杯中,加入去離子水,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的SPI溶液,室溫下攪拌15 min使其混勻,于55 ℃水浴下預(yù)熱45 min后,加入0.01 mol/L的HCl溶液使其pH維持在6.0,加入8000 U/g木瓜蛋白酶進行酶解,4 h后于90 ℃下滅酶5 min,冷卻至室溫,用0.01 mol/L的NaOH溶液滴定至pH為7.0,記錄消耗的NaOH溶液體積,以控制水解度在6%,獲得酶解物后取出,烘干備用[13]。水解度(DH)采用pH-stat法[14]測定。

1.2.2 TGase交聯(lián)大豆分離蛋白酶解物對其吸油性、保水性的影響 將1.2.1酶解物配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的溶液,調(diào)整至一定pH后加入一定量的TGase,在一定溫度下溫度下交聯(lián)一段時間,交聯(lián)結(jié)束后在80 ℃下滅酶5 min,獲得交聯(lián)物后取出,烘干后測定其吸油性、保水性[15]。

1.2.2.1 TGase添加量 以大豆分離蛋白酶解物溶液為底物,TGase添加量分別10、20、30、40、50 U/g,在pH7.0,交聯(lián)溫度55 ℃,交聯(lián)時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用,測定TGase改性后樣品的吸油性和保水性。

1.2.2.2 pH 以大豆分離蛋白酶解物溶液為底物,分別調(diào)節(jié)pH至5、6、7、8、9,在TGase添加量20 U/g,交聯(lián)溫度55 ℃,交聯(lián)時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用,測定TGase改性后樣品的吸油性和保水性。

1.2.2.3 交聯(lián)溫度 以大豆分離蛋白酶解物溶液為底物,交聯(lián)溫度分別25、35、45、55、65 ℃,在TGase添加量20 U/g,pH7.0,交聯(lián)時間1 h的條件下進行交聯(lián)作用,測定TGase改性后樣品的吸油性和保水性。

1.2.2.4 交聯(lián)時間 以大豆分離蛋白酶解物溶液為底物,交聯(lián)時間分別0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,在TGase添加量20 U/g,pH7.0,交聯(lián)溫度55 ℃的條件下進行交聯(lián)作用,測定TGase改性后樣品的吸油性和保水性。

1.2.3 吸油性與保水性的測定 將0.5 g樣品與10 mL大豆油或蒸餾水放入已稱重的離心管,充分?jǐn)嚢杈鶆蚝箪o置30 min,于3000 r/min下離心20 min,棄去上層油相或水相,稱取離心管及沉淀的總質(zhì)量[16]。按以下公式計算樣品的吸油性(OHC)或保水性(WHC),單位定義為g/g。

式中:M0為樣品的質(zhì)量,g;M1為離心管的質(zhì)量,g;M2為離心后離心管與所得沉淀的總質(zhì)量,g。

1.2.4 TGase交聯(lián)大豆分離蛋白酶解物交聯(lián)度的測定 使用鄰苯二甲醛(OPA)法[17]測定反應(yīng)體系中自由氨基的含量,以甘氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)物[18]繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。TGase作用大豆分離蛋白酶解物的反應(yīng)程度以交聯(lián)度表示[19]。

交聯(lián)度(%)=(原料中自由氨基含量-樣品中自由氨基含量)/原料中自由氨基含量

1.2.5 TGase改善大豆分離蛋白酶解物吸油性的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 在相同單因素條件下,TGase對SPI酶解物的保水性改善作用較弱,而對吸油性改善效果理想,因此采用Design Expert 10實驗設(shè)計及統(tǒng)計分析軟件中的Box Behnken程序,以吸油性為指標(biāo),進行響應(yīng)曲面優(yōu)化實驗。并結(jié)合單因素實驗結(jié)果確定酶添加量、pH、交聯(lián)溫度和交聯(lián)時間四個主要考察因素的水平取值范圍,水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化吸油性的因素水平編碼表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.2.6 粒徑與Zeta電位的測定 分別取0.1 g SPI原料、SPI酶解物和不同交聯(lián)時間下的樣品溶解于10 mL去離子水中,使用高速分散器均質(zhì)(5000 r/min,2 min)使其完全混合,離心后(3000 r/min,10 min)取上清液,用0.45 μm膜過濾后,測定粒徑及Zeta電位[20]。

1.2.7 自由氨基含量的測定 分別取SPI原料、SPI酶解物和不同交聯(lián)時間下的樣品稀釋到一定倍數(shù),取100 μL,使用OPA法[17]測定反應(yīng)體系中自由氨基含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007軟件繪圖,SPSS Statistics 17.0軟件統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù),每組實驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用t檢驗,當(dāng)P<0.05 時,表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 TGase改善SPI酶解物吸油性、保水性

2.1.1 SPI原料及SPI酶解物吸油性、保水性測定結(jié)果 經(jīng)過測定與計算,SPI原料的吸油性與保水性分別為3.73和14.52 g/g;SPI酶解物的吸油性與保水性分別為3.98 和14.82 g/g。

2.1.2 交聯(lián)度測定結(jié)果 在TGase添加量20 U/g,pH7.0,交聯(lián)溫度55 ℃,交聯(lián)時間分別0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的條件下,測得交聯(lián)度分別為33.85%、46.46%、66.14%、52.36%、52.75%。

2.1.3 TGase交聯(lián)SPI酶解物對其吸油性、保水性的影響

2.1.3.1 加酶量對TGase改善SPI吸油性、保水性的影響 圖1所示,隨著酶添加量的增加,交聯(lián)樣品的吸油性和保水性也隨之增強,當(dāng)酶添加量為20 U/g時均達到最大,分別為5.38和13.83 g/g,而后呈現(xiàn)下降趨勢。原因可能是TGase酶的加入使蛋白分子之間發(fā)生交聯(lián)作用,當(dāng)加酶量達到20 U/g時,SPI酶解物中存在的小分子幾乎全部被交聯(lián)成大分子并形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),有利于對油和水的束縛,所以吸油性和保水性提高。但TGase酶的過度加入使反應(yīng)體系中SPI酶解物的純度下降,限制蛋白分子之間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成,不利于持油與持水。研究表明,隨著 TGase 酶用量的增加,蛋白會有所膨脹,持油性減小[21]。因此酶添加量為20 U/g較為適宜。

圖1 加酶量對TGase交聯(lián)SPI酶解物吸油性、保水性的影響Fig.1 Effect of TGase addition amount on the oil absorptionand water retention of TGase crosslinked SPI hydrolysates

2.1.3.2 pH對TGase改善SPI吸油性、保水性的影響 圖2所示,交聯(lián)樣品的吸油性和保水性均先升高后降低,當(dāng)pH為7.0時達到最大,分別為5.39和13.86 g/g。由此可分析出,pH對TGase交聯(lián)SPI酶解物的吸油性和保水性均有影響。pH影響轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性和穩(wěn)定性,過酸或過堿會降低轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性,不適宜交聯(lián)作用的發(fā)生,中性環(huán)境是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)作用的最佳條件[22],因而pH越接近于7.0,其吸油性和保水性越好。另外,pH影響蛋白的溶解性,會改變其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[23],酸堿條件下交聯(lián)樣品的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)空隙變大,從而導(dǎo)致其吸油性和保水性的變化。因此交聯(lián)反應(yīng)的較優(yōu)pH為7.0。

圖2 pH對TGase交聯(lián)SPI酶解物吸油性、保水性的影響Fig.2 Effect of pH on the oil absorption and waterretention of TGase crosslinked SPI hydrolysates

2.1.3.3 交聯(lián)溫度對TGase改善SPI吸油性、保水性的影響 圖3所示,吸油性隨著溫度的升高而增大,當(dāng)溫度為55 ℃時達到峰值,為5.40 g/g,而后有所下降。之所以出現(xiàn)此趨勢可能是因為在低溫時,TGase的酶活也較低,不利于交聯(lián),而溫度過高又會使TGase逐漸失活,同時導(dǎo)致反應(yīng)體系不穩(wěn)定或蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[24],從而使交聯(lián)反應(yīng)不能順利進行,吸油性降低。因此TGase改善SPI酶解物吸油性的最佳交聯(lián)溫度受酶的活性、原料結(jié)構(gòu)和反應(yīng)體系等原因影響,55 ℃較為適宜。

圖3 交聯(lián)溫度對TGase交聯(lián)SPI酶解物吸油性、保水性的影響Fig.3 Effect of crosslinking temperature on the oil absorptionand water retention of TGase crosslinked SPI hydrolysates

保水性在低于45 ℃的交聯(lián)條件下較為平緩,35 ℃時達到峰值,為17.28 g/g,當(dāng)交聯(lián)溫度高于45 ℃后急劇下降,說明較低的溫度有利于TGase改善SPI酶解物的保水性。一方面可能是因為溫度的高低影響著TGase的酶活,從而影響交聯(lián)程度。另一方面在交聯(lián)過程中,蛋白側(cè)鏈的親水基向水相移動,疏水基向油相移動,溫度的高低則影響著基團移動速率,從而導(dǎo)致其疏水性改變[25]。因此,在多重原因的共同作用下,得到TGase改善SPI酶解物保水性的較佳交聯(lián)溫度為45 ℃。

2.1.3.4 交聯(lián)時間對TGase改善SPI吸油性、保水性的影響 圖4所示,隨著交聯(lián)時間的延長,交聯(lián)樣品的吸油性和保水性均隨之增強,交聯(lián)時間1.0 h時達到最大值,分別為5.40和13.20 g/g,而后下降。原因可能是反應(yīng)時間太短,則不能將SPI酶解物很好交聯(lián),還未形成良好結(jié)構(gòu),所以持油和持水能力較低。隨著時間延長,蛋白分子之間逐漸交聯(lián)成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[26],益于對油和水的束縛。當(dāng)交聯(lián)的時間過長,形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)又會遭到不同程度的破壞,從而導(dǎo)致吸油和保水能力變差,因此交聯(lián)時間不宜過短或過長,1.0 h最為合適。

圖4 交聯(lián)時間對TGase交聯(lián)SPI酶解物吸油性、保水性的影響Fig.4 Effect of crosslinking time on the oil absorptionand water retention of TGase crosslinked SPI hydrolysates

2.2 TGase改善SPI酶解物吸油性的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計結(jié)果分析

通過單因素實驗發(fā)現(xiàn),TGase可以改善SPI酶解物的吸油性,但保水性只有在加酶量為20 U/g,pH為7.0,交聯(lián)時間為1 h,溫度分別為25、35、45 ℃的條件下,較SPI和SPI酶解物有所提高。因此只對TGase改善SPI酶解物吸油性進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。

2.2.1 試驗結(jié)果及模型方差分析 響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2,以回歸系數(shù)建立大豆分離蛋白酶解物吸油性(Y)與酶添加量(X1)、pH(X2)、交聯(lián)溫度(X3)、交聯(lián)時間(X4)的響應(yīng)面回歸方程為:

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface design

2.2.2 因素交互作用響應(yīng)面分析 結(jié)合二次回歸方程及表3可知,二次項X1X4具有顯著的交互作用(P<0.05),X1X2、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4的交互作用極為顯著(P<0.01)。通過3D響應(yīng)面與等高線可以解釋說明自變量與因變量之間的關(guān)系,如圖5～圖10所示。

圖5 加酶量與pH交互作用對吸油性的影響Fig.5 Effect of interaction betweenenzyme addition and pH on oil absorption

圖6 加酶量與溫度交互對吸油性的影響Fig.6 Effect of interaction betweenenzyme addition and temperature on oil absorption

圖7 加酶量與時間交互作用對吸油性的影響Fig.7 Effect of interaction betweenenzyme addition and time on oil absorption

圖8 pH與溫度交互作用對吸油性的影響Fig.8 Effect of interaction betweenpH and temperature on oil absorption

圖9 pH與時間交互作用對吸油性的影響Fig.9 Effect of interaction betweenpH and time on oil absorption

圖10 溫度與時間交互作用對吸油性的影響Fig.10 Effect of interaction betweentemperature and time on oil absorption

比較酶添加量、pH、交聯(lián)溫度、交聯(lián)時間四因素的兩兩交互作用對大豆分離蛋白酶解物吸油性的影響結(jié)果發(fā)現(xiàn),響應(yīng)值呈現(xiàn)拋物線形趨勢,均先升高后降低,因此回歸方程存在極大值。得到TGase改善SPI酶解物吸油性最優(yōu)條件:酶添加量21.2 U/g、pH7.1、交聯(lián)溫度53.0 ℃、交聯(lián)時間1.2 h,重復(fù)試驗3次并計算出吸油性平均值為5.41 g/g,與理論預(yù)測值5.416 g/g相比,其相對誤差為0.111%,說明該模型擬合情況良好,結(jié)果可靠。

2.3 吸油性、保水性與理化性質(zhì)之間的相關(guān)關(guān)系

2.3.1 粒徑與吸油性、保水性之間的相關(guān)性分析 SPI經(jīng)酶解后粒徑減小,而TGase的交聯(lián)作用又使SPI酶解物的粒徑增大,通過SPSS軟件中相關(guān)性分析得出,粒徑大小與吸油性之間并不存在相關(guān)性(r=0.097,P>0.05),如圖11a。而粒徑大小與保水性之間存在著顯著負相關(guān)(r=-0.865,P<0.01),如圖11b所示,這與楊峰等[27]得出的結(jié)論一致。

圖11 粒徑與吸油性、保水性之間的相關(guān)性Fig.11 Correlation between particle sizeand oil absorption and water retention

2.3.2 Zeta電位與吸油性、保水性之間的相關(guān)性分析 圖12a所示,可以看出隨著Zeta電位絕對值的增加,其吸油性會出現(xiàn)明顯的上升趨勢。通過相關(guān)性分析得出,Zeta電位絕對值的大小與吸油性之間呈顯著正相關(guān)(r=0.878,P<0.01)。但Zeta電位絕對值的大小與保水性之間呈負相關(guān)(r=-0.531,P<0.05),如圖12b所示。

圖12 電位與吸油性、保水性之間的相關(guān)性Fig.12 Correlation between zeta potentialand oil absorption and water retention

2.3.3 自由氨基含量與吸油性、保水性之間的相關(guān)性分析 圖13a為自由氨基含量與吸油性之間的關(guān)系。由SPSS軟件中相關(guān)性分析得出,自由氨基含量與吸油性之間呈顯著負相關(guān)(r=-0.595,P<0.01)。SPI經(jīng)酶解后自由氨基的含量會增加,再進行不同時間條件下的TGase交聯(lián),產(chǎn)物的自由氨基含量變化不同[28]。經(jīng)TGase改性后的產(chǎn)物自由氨基含量會有所降低,出現(xiàn)此現(xiàn)象是由于TGase是能夠催化酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的酶,在發(fā)生交聯(lián)作用時會對蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生脫氨作用,從而將肽段上的氨基轉(zhuǎn)變?yōu)镹H3脫離體系[29]。其次TGase使蛋白質(zhì)分子賴氨酸上ε-氨基和谷氨酸上的γ-羥酰胺基結(jié)合,使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間形成ε-(γ-谷氨酰)-賴氨酸肽鍵,導(dǎo)致自由氨基含量降低[30]。自由氨基含量少,吸油性反而大。自由氨基含量的變化引起其吸油性的顯著變化,說明自由氨基的含量可以影響其吸油性能,同時也印證了交聯(lián)作用的發(fā)生。通過分析圖13b中自由氨基的含量與保水性相關(guān)關(guān)系發(fā)現(xiàn),保水性與自由氨基含量之間的相關(guān)性較差,自由氨基含量的變化并未導(dǎo)致其保水性能顯著的升高或降低。由相關(guān)性分析可得出,自由氨基含量與保水性之間無相關(guān)性(r=0.062,P>0.05)。

圖13 自由氨基含量與吸油性、保水性之間的相關(guān)性Fig.13 Correlation between free amino contentand oil absorption and water retention

3 結(jié)論

以大豆分離蛋白為實驗原料,通過木瓜蛋白酶酶解獲得酶解物后,再利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在不同條件下交聯(lián),結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化試驗確定TGase添加量21.2 U/g、pH7.1、交聯(lián)溫度53.0 ℃、交聯(lián)時間1.2 h為最優(yōu)條件,此時吸油性為5.41 g/g,較TGase改性前的SPI酶解物提高35.93%,較SPI原料提高45.04%。

在相同的單因素條件下,發(fā)現(xiàn)TGase對SPI酶解物保水性的改善作用較弱,只有當(dāng)TGase添加量20 U/g、pH7.0、交聯(lián)時間1.0 h、溫度分別為25、35、45 ℃時,保水性高于SPI原料及SPI酶解物,保水性分別為16.48、17.28、16.61 g/g,在交聯(lián)溫度35 ℃時保水性最大,較TGase改性前的SPI酶解物提高16.60%,較SPI原料提高19.01%。

通過分析粒徑、Zeta電位、自由氨基含量與吸油性、保水性之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)粒徑大小與吸油性之間不存在相關(guān)性,與保水性之間存在著顯著負相關(guān)。Zeta電位絕對值的大小與吸油性之間呈顯著正相關(guān),與保水性之間呈負相關(guān)。自由氨基含量與吸油性之間呈顯著負相關(guān),與保水性之間無相關(guān)性。