王茂廣

(臨沂大學(xué)，臨沂 276005)

沙棘(sea buckthorn)為胡頹子科沙棘屬落葉灌木［1］。我國是沙棘屬植物分布區(qū)面積最大、種類最多的國家［2］。沙棘籽中蛋白質(zhì)、維生素等有效成分具有清除人體自由基、提高機體免疫功能的作用，在醫(yī)藥、保健和食品領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景［3］。沙棘籽中的氨基酸種類齊全，包含人體全部的必需氨基酸［4］。近年來，與蛋白質(zhì)有關(guān)的抗氧化的研究已引起食品科學(xué)界的高度關(guān)注。Rozenn［5］已從鯉魚酶解物中提取出抗氧化活性肽。丁利君等［6］采用枯草桿菌堿性蛋白酶酶解液，以清除羥自由基的效果為分析指標，研究了非洲鯽魚蛋白酶解物的抗氧化能力。目前對沙棘漿果和種子的利用僅限于制作飲料和提取沙棘油，而對于沙棘籽的抗氧化作用尚未見報道［7］。本研究對沙棘籽蛋白酶解物的抗氧化能力進行初步研究，為沙棘資源在醫(yī)藥、保健品方面的應(yīng)用進行探索，為沙棘籽蛋白酶解物作為天然抗氧化劑和功能性食品的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘籽:內(nèi)蒙古水域山飲品有限責(zé)任公司;堿性蛋白酶:南寧龐博生物工程有限公司;氯化硝基四氮唑藍、四甲基乙二胺、核黃素、硫代巴比妥酸、維生素C、2，6－二叔丁基對甲酚:天津博迪化工有限公司。化學(xué)試劑均為分析純。

微型植物試樣粉碎機:河北黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠;752紫外分光光度計:上海光譜儀器有限公司;TGL－16B臺式離心機:上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘籽蛋白酶解物的制備

稱取沙棘籽10 g，粉碎過篩除去雜質(zhì)，用無水乙醇浸泡12 h，于40℃下烘干，將處理后的沙棘籽和1 mol/L NaOH按照1∶10的比例攪拌勻質(zhì)，37℃下水浴2 h，4 000 r/min離心15 min，得到上清液，加入水楊酸調(diào)pH 4.8進行酸沉，4 000 r/min離心15 min后，得到蛋白沉淀后風(fēng)干。將沙棘蛋白溶于蒸餾水中，加堿性蛋白酶，在料液比1∶10，加酶量260 U/g，60℃下水解2 h，然后在100℃下滅酶5 min［8］，獲得水解度為22%的蛋白質(zhì)酶解液。試驗中沙棘籽蛋白溶液的濃度通過考馬斯亮藍法測定，根據(jù)牛血清蛋白標準曲線，得到的蛋白提取液中粗蛋白的濃度約為 4 mg/mL。分別配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL質(zhì)量濃度的沙棘蛋白酶解液，以相同濃度的維生素C作為對照組。

1.2.2 沙棘籽蛋白酶解物還原能力的測定

加入0.2 mol/L pH 6.6的混合磷酸鹽緩沖液和1%K3Fe(CN)6溶液各2.5 mL并混合均勻，混合液在50℃下反應(yīng)20 min后自然冷卻，采用六氰合鐵酸鉀法［9］，于700 nm處測定吸光度。

1.2.3 沙棘籽蛋白酶解物抗脂質(zhì)過氧化活性的測定

采用亞油酸加速氧化法［10］。

1.2.4 沙棘籽蛋白酶解物對羥基自由基引發(fā)DNA氧化損傷的保護作用

采用硫代巴比妥分光光度法［11］。

1.2.5 沙棘籽蛋白酶解物對超氧陰離子自由基的清除

利用核黃素(RFV)、四甲基乙二胺(TEMED)光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生O2－·，O2－·可將氯化硝基四氮唑藍(NBT)還原為藍色產(chǎn)物，試驗采用劉平等［12］提供的方法。

1.2.6 沙棘籽蛋白酶解物對羥基自由基的清除

采用D－脫氧核糖－Fe體系法［13］。不同濃度梯度的蛋白酶解液2 mL，依次加入9 mmol/L FeSO4溶液2 mL，9 mmol/L水楊酸溶液2 mL，最后加入8.8 mmol/L H2O22 mL啟動整個反應(yīng)，37℃水浴30 min，并作空白試驗，以蒸餾水作參比，在510 nm下測定吸光度。

1.2.7 沙棘籽蛋白酶解物對DPPH自由基的清除

吸取2 mL樣液到試管中，加2 mL 0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液，室溫靜置20 min，于517 nm處測定吸光度。以空白作參比，清除率按下式計算［14］。

清除率(%)=［1－(A－A1)/A0］×100

式中:A0為DPPH與無水乙醇吸光度;A1為樣品與無水乙醇吸光度;A為樣品與DPPH吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘籽蛋白酶解物還原能力的測定

沙棘籽蛋白酶解物和維生素C的還原能力如圖1所示。沙棘籽蛋白酶解物質(zhì)量濃度在0.2～0.8 mg/mL的范圍內(nèi)，還原能力隨著濃度的增大而增大，質(zhì)量濃度增大到1.0 mg/mL時，還原能力有所下降，原因可能是該濃度下沙棘籽蛋白酶解物提供的還原基團有限，相同濃度沙棘籽蛋白酶解物的還原能力低于維生素C。通過本試驗得出沙棘籽酶解物抗氧化能力最適酶解液質(zhì)量濃度約為0.8 mg/mL。

圖1 沙棘籽蛋白酶解物還原能力的測定

2.2 沙棘籽蛋白酶解物的抗脂質(zhì)過氧化活性

由圖2可以看出，沙棘籽蛋白酶解物抗脂質(zhì)過氧化活性隨著濃度的增大而增大，且呈現(xiàn)出很強的劑量效應(yīng)，在1.0 mg/mL時其抗脂質(zhì)過氧化活性可達30%?？梢?，沙棘籽蛋白酶解物具有一定的抗脂質(zhì)過氧化能力。本試驗中樣品的抑制率較低的原因，可能是沙棘籽蛋白酶解物在亞油酸體系中沒有很好的分散，在溶解蛋白質(zhì)過程中造成蛋白質(zhì)的游離羥基減少。

圖2 沙棘籽蛋白酶解物的抗脂質(zhì)過氧化活性

2.3 沙棘籽蛋白酶解物對羥基自由基引起DNA損傷的保護作用的測定

羥基自由基能攻擊DNA的戊糖和堿基，引起鏈的斷裂。不同濃度沙棘籽蛋白酶解液對羥基自由基引起DNA損傷的保護作用不同，試驗以抑制率為參考指標，由圖3可以看出，隨著沙棘籽蛋白酶解液濃度的增大，其對DNA損傷的抑制率越大，最大約為70%。與維生素C相比，在0.2～0.8 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其抑制率略小或與之相當，表明沙棘籽蛋白酶解物對羥基自由基引起DNA損傷的保護能力較強。羥基自由基致DNA損傷的化學(xué)反應(yīng)機制十分復(fù)雜，本方法是一種體外評價抗氧化劑對DNA損傷保護作用的方法，該方法是否可以用于體內(nèi)試驗，尚待研究。

圖3 沙棘籽蛋白酶解物對羥基自由基引起DNA損傷的抑制率

2.4 沙棘籽蛋白酶解物對超氧陰離子自由基清除率的測定

從圖4可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，沙棘籽蛋白酶解物對超氧陰離子的清除作用逐漸增強，且清除率與樣品液的濃度呈現(xiàn)出一定的線性規(guī)律，從0.2 mg/mL時的10.4%增長到1.0 mg/mL時的81.7%。張紅城等［13］研究茶花花粉蛋白酶解物的抗氧化能力表明，各個水解度下其清除能力均隨著樣品濃度的增加而增加。試驗表明，沙棘籽蛋白酶解物呈現(xiàn)出較好的清除超氧陰離子自由基的能力。

圖4 沙棘籽蛋白酶解物對超氧陰離子自由基清除率的測定

2.5 沙棘籽蛋白酶解物對羥基自由基清除率的測定

從圖5可以看出，待測樣品和對照組對羥基自由基的清除率均隨著試樣濃度的提高而增大，并且2條清除曲線大致重合，在1.0 mg/mL質(zhì)量濃度下對羥基自由基的清除率都接近60%，表明在質(zhì)量濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，沙棘酶解物對羥基自由基的清除作用與維生素C大致相當。

圖5 沙棘籽蛋白酶解物對羥基自由基清除率的測定

2.6 沙棘籽蛋白酶解物對DPPH自由基清除率的測定

從圖6可以看出，在試驗濃度范圍內(nèi)，沙棘籽蛋白酶解物對DPPH自由基的清除率并沒有隨酶解物濃度的變化產(chǎn)生大的差異。相同濃度沙棘籽蛋白酶解液對DPPH自由基的清除率小于維生素C，但在試驗濃度范圍內(nèi)，其抑制率也保持在60%左右。

圖6 沙棘籽蛋白酶解物對DPPH自由基清除率的測定

3 結(jié)論

本研究以沙棘籽為研究對象，通過堿溶法提取沙棘蛋白，獲得沙棘蛋白酶解物。通過測定對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基的清除率，其最高的清除率分別達到81.7%、60%、65.2%，較為全面地反映沙棘籽蛋白酶解物的抗氧化性能，為今后的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。另外，試驗測定了沙棘蛋白酶解物對羥基自由基引起DNA損傷的保護作用，為沙棘蛋白抗氧化修復(fù)再生細胞機能的衡量提供理論依據(jù)，同時在其抗氧化方面進行了探究。

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