謝英偉 金仕鵬 李 爽 王永輝 王 偉 平 浩 劉躍新

(首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院泌尿外科，北京 100730)

前列腺癌是目前全球男性最常見的惡性腫瘤之一。隨著疾病的進展，多數(shù)前列腺癌將轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌 (metastatic castration resistant prostate cancer，mCRPC)[1]，目前，多西他賽為轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌患者的一線治療藥物[2]。然而約50%的患者對化學藥物治療(以下簡稱化療)先天耐受，起初對化療敏感的患者最終也會發(fā)展為化療耐受。臨床觀察[3]和實驗研究[4]表明化療耐藥與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關。如化療耐藥的腫瘤易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移的腫瘤具有更強的化療耐藥性。本課題組[5]研究發(fā)現(xiàn)TMPRSS2-ERG(T-E)融合基因更易出現(xiàn)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的前列腺癌中。本研究對前列腺癌化療患者進行融合基因的測定，以評估融合基因與化療耐藥之間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究選取首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院前列腺增生患者20例，前列腺癌化療患者50例為研究對象，前列腺增生患者平均年齡(73.58±5.88)歲，前列腺癌化療的患者骨轉(zhuǎn)移者43例，骨及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移者7例，平均年齡(75.22±5.61)歲。前列腺癌化療患者的納入標準：①初診時有明確的經(jīng)前列腺穿刺活檢或手術標本確診為前列腺癌的病理報告；②行全身骨掃描，胸、腹部CT檢查明確有骨和(或)內(nèi)臟轉(zhuǎn)移者，M分期為Mlb、Mlc的轉(zhuǎn)移患者；③均經(jīng)過藥物或手術去勢后出現(xiàn)前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)緩解一段時間后再升；④均有明確初始PSA值及化療前PSA值；⑤確診時具有以Gleason評分為標準的前列腺癌病理分級；⑥患者均符合mCRPC，剔除行二線內(nèi)分泌或其他治療方法，均行多西他賽聯(lián)合潑尼松全身化療方案者。

1.2 研究方法

1.2.1 RNA的提取

化療開始前，利用EDTA管收集外周血樣10 mL。將樣品在4 ℃保存最多2 h直至處理。用吸管小心加到相對體積質(zhì)量為1.072的淋巴細胞分離液的離心管液面上。離心后，分離外周血單核細胞，并使用TRI-Reagent(美國賽默飛世爾科技公司)根據(jù)制造商的說明提取總RNA。通過ND-1000分光光度計(美國Nanodrop 科技公司)定量RNA。

1.2.2 實時定量聚合酶鏈反應(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)

使用High Capacity cDNA Archive Kit(美國賽默飛世爾科技公司)對0.5 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。使用TaqMan PreAmp Master Mix Kit(美國賽默飛世爾科技公司)，將T-E和管家基因GUSB預擴增14個循環(huán)，不同的是反應的最終體積減少至12.5 μL。在StepOne Plus實時PCR系統(tǒng)(美國Life科技公司)中進行qRT-PCR。使用SDS軟件1.4獲取數(shù)據(jù)。擴增反應一式兩份進行。表達值基于靶基因相對于GUSB內(nèi)源基因的Cq的定量循環(huán)(Cq)。商業(yè)引物和探針用于擴增T-E和GUSB基因(分別為Hs03063375_ft和Hs99999908_m1; 美國賽默飛世爾科技公司)。本研究分別使用T-E和GUSB的閾值0.1和0.2來記錄Cq數(shù)據(jù)。

1.2.3T-E分類

當在一式兩份反應中檢測到T-E基因和管家基因GUSB(Cq≤35)時，患者歸類為T-E陽性。 當可檢測到GUSB但未檢測到T-E(未確定的Cq)時，患者歸類為T-E陰性。

1.3 隨訪和評估

每3～6周測量PSA濃度，并且每2～4個月或根據(jù)臨床情況進行CT和/或骨掃描檢查。 PSA反應率定義為在治療開始后的任何時間PSA從基線(維持>4周)至少減少50%。 PSA-無進展生存期(progression free survival,PFS)，放射學無進展生存期(radiological progression free survival, RX-PFS)和總生存期(overall survival,OS)分別為從服用多西他賽開始計算到PSA進展，放射學進展和死亡或最后一次隨訪時。 治療反應標準和疾病進展性定義遵循前列腺癌臨床試驗工作組標準[6]。PSA進展定義為PSA值升高較最低值至少增加25%并在3周后確認。放射學進展定義為治療期間或治療后骨掃描顯示新出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移灶≥2個，且在以后 (≥2個月)再次骨掃描時得到確認，則為進展；其他可測量轉(zhuǎn)移灶采用實體瘤的新反應評估標準(RECIST評價標準)[7]，比較治療前后的CT或MRI檢查結(jié)果?；颊唠S訪時間直至死亡或最后一次就診。PSA倍增時間(PSA doubling time, PSADT)定義為化療前PSA達到最低值后再次測量PSA增2倍需要的時間。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

在20例前列腺增生患者中未檢測到T-E融合基因。在50例多西他賽化療的mCRPC患者外周血中，10例(20.0%)檢測為T-E陽性，40例(80.0%)為陰性。根據(jù)T-E表達對患者進行分組，除初始PSA、PSADT、激素敏感時間外，mCRPC患者的基線特征，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表1)。

表1T-E融合基因陽性與陰性組之間的腫瘤特征

FactorsT-E negative(n=40)T-E positive(n=10)tPFactors at diagnosis Age/a74.89±5.0176.25±7.560.16 PSA/(ng·mL-1)45.07±36.0481.86±135.920.02Gleason score0.010.94 ≤7276 >7134Factors at the start of chemotherapyPSADT/month27.53±17.6819.43±12.570.06ECOG score0.200.66 091 ≥1319Hormone sensitive time/month32.82±21.0521.05±15.120.04WBC/(109×L-1)6.89±4.736.57±4.140.71HB /(g·L-1)117.24±31.35112.31±34.640.67

T-E:TMPRSS2-ERG;PSA: prostate specific antigen;PSADT: prostate specific antigen doubling time;ECOGscore: Eastern Cooperative Oncology Group;WBC: white blood cell;HB:hemoglobin.

T-E陽性患者的PSA反應率低于陰性患者(分別為32.52%和74.35%，P=0.040)(圖1)。T-E陽性患者的PSA-PFS，RX-PFS和OS低于陰性患者，差異均有統(tǒng)計學意義(圖2～4)。

圖1 T-E PSA反應率Fig.1 PSA response rate in T-E T-E: TMPRSS2-ERG; PSA: prostate specific antigen.

圖2 PSA無進展生存期Fig.2 PSA progession free survivalT-E: TMPRSS2-ERG; PSA: prostate specific antigen.

圖3 T-E患者的放射學無進展生存期 Fig.3 RX-PFS in T-E positive and negative patientsT-E: TMPRSS2-ERG;RX-PFS:radiologic progression-free survival.

圖4 總生存期 Fig.4 Overall survivalT-E: TMPRSS2-ERG.

多因素Cox分析結(jié)果顯示，Gleason評分、PSADT、激素敏感時間、T-E與PSA-PFS，RX-PFS和OS相關(P<0.05),HB與OS相關(P<0.05)，詳見表2。

表2 mCRPC患者PSA-PFS，RX-PFS和OS的多因素Cox回歸分析

mCRPC:metastatic castration resistant prostate cancer;PSA:prostate specific antigen;PFS:progression free survival;RX-PFS:radiological progression free survival;OS: overall survival;PSADT:prostate specific antigen doubling time;ECOG:Eastern Cooperative Oncology Group;WBC:white blood cell;HB:hemoglobin.

3 討論

我國PSA篩查存在地區(qū)差異，高危進展性及轉(zhuǎn)移性前列腺癌(metastatic prostate cancer，mPC)患者所占比例較高[8-9]。腫瘤耐藥是導致前列腺癌化療失敗的重要原因。

基因融合是指基因在染色體上發(fā)生位置錯位、 融合的現(xiàn)象，從而產(chǎn)生新的融合基因，該基因可能具有新的功能。T-E基因融合是前列腺癌中已知最常見的遺傳改變。T-E融合基因的發(fā)生率在不同人種之間存在明顯差異。歐美幾個研究中心樣本量超過500例的研究[10]顯示T-E融合基因發(fā)生率約為50%。陶晶等[11]、Qi等[12]及Dong等[13]在前列腺癌組織中T-E融合基因檢出率分別為19.8%、23.2%、14.3%。

在本研究中，20%的mCRPC患者檢測到T-E融合基因。分析融合基因與臨床結(jié)果的關系時，發(fā)現(xiàn)T-E融合基因陽性患者在多西他賽化療后PSA-PFS，RX-PFA和OS低于陰性組。這些結(jié)果表明T-E融合基因是預測mCRPC患者多西他賽化療耐藥的潛在生物標志物。這與當前部分結(jié)果研究一致。在Galletti等[14]的1項研究中，11例(32.4%)患者T-E融合陽性，ERG表達陽性患者對多西他賽的PSA反應率與陰性相比,差異有統(tǒng)計學意義(陽性45%vs陰性79%，P<0.05)。此外，Reig等[15]報道，50例多西他賽治療的mCRPC患者中有8例(16%)外周血中T-E融合基因陽性。這一發(fā)現(xiàn)也與較低的PSA反應率：PSA-PFS、C/R-PFS和OS相關。研究[16]顯示外周血中檢測到的ERG表達與用多西他賽化療的mCRPC患者較低的PSA-PFS、C/R-PFS和OS相關。

目前關于T-E融合基因與前列腺癌化療耐藥的具體機制還沒有明確。Galletti等[14]證明ERG與可溶性微管蛋白結(jié)合并降低紫杉烷-微管蛋白相互作用，導致紫杉烷敏感性受損。此外，T-E誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這也與CRPC中的紫杉烷抗性有關[17]。

本研究雖然顯示T-E融合基因與前列腺癌化療耐藥有關，但是樣本量相對較小，而且融合基因陽性的患病率不高。同時這也是一個單中心的試驗，可能對患者選擇有偏倚。下一步需要更大量的樣本及多中心的研究進一步明確兩者之間的關系。

總之，本研究的結(jié)果表明，T-E融合基因的表達與多西他賽化療的mCRPC患者中較低的PSA-PFS、RX-PFS和OS相關。因此，它們可以用作預測mCRPC患者中多西紫杉醇治療的潛在生物標志物。