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基于TGF-β1/Smad3信號通路觀察rb-bFGF在糖尿病大鼠燒傷創(chuàng)面愈合中的作用機(jī)制

2020-06-17 11:52張萍蔣仕秋陳雪蓮王寬劉漪淪
疑難病雜志 2020年6期
關(guān)鍵詞:纖維細(xì)胞新生創(chuàng)面

張萍,蔣仕秋,陳雪蓮,王寬,劉漪淪

糖尿病(DM)合并難愈合創(chuàng)面是常見的糖尿病并發(fā)癥之一[1]。其病程長、難以治愈、截肢率高,嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[2-3]。臨床中已有多種藥物治療糖尿病性皮膚創(chuàng)面,且具有治愈率高、無新生創(chuàng)面、不良反應(yīng)低等特點(diǎn),其中重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子(rb-bFGF)作為一種最常見的外用藥物之一,在促進(jìn)組織修復(fù)及創(chuàng)面愈合中發(fā)揮重要的作用,但其作用機(jī)制尚不完全明確[4]。TGF-β1/ Smad3 (Smad3蛋白)信號通路是創(chuàng)面愈合中最重要的調(diào)控途徑[5]。TGF-β1廣泛介導(dǎo)細(xì)胞的多種功能,其根據(jù)細(xì)胞活化或分化程度的不同,雙向調(diào)節(jié)目的細(xì)胞功能,促進(jìn)創(chuàng)面的愈合;Smad3蛋白是TGF-β1最重要的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白[6]。因此本研究通過糖尿病大鼠燙傷模型制備糖尿病難愈合創(chuàng)面,觀察TGF-β1/Smad3信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化,以揭示rb-bFGF在創(chuàng)面愈合中的作用機(jī)制,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物:無特定病原體(SPF)級雄性 SD 大鼠100只,8~10周齡,體質(zhì)量200~250 g,由北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(許可證號2019-0005A);依照北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理辦法,室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。(2)試藥試劑:rb-bFGF(珠海億勝生物制藥有限公司生產(chǎn)),人重組 TGF-β1 購自美國 Peprotech公司,HE染色檢測試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司,免疫組化試劑盒購自美國Amresco公司,Western-blot試劑盒購自Santa Cruz公司,TGF-β1、Smad3單克隆抗體購自美國CST公司,鏈脲佐菌素(STZ)購自華北制藥廠。(3)儀器:CellInsight激光共聚焦顯微鏡(Thermofisher生產(chǎn)),E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Beckma公司生產(chǎn)),DM2500生物電鏡(德國徠卡公司生產(chǎn)),Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國Fermentas公司生產(chǎn)),血糖儀(美國Johnson公司生產(chǎn))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2018年3—9月于成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院科研實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 SD大鼠100只隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、TGF-β1組、實(shí)驗(yàn)組,每組25只。對照組大鼠僅予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng);模型組、TGF-β1組、實(shí)驗(yàn)組大鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng)1個月后,按STZ 50 mg/kg大鼠腹腔注射,對照組注射等體積無菌生理鹽水;3 d后,尾靜脈血糖儀測血糖,空腹血糖>16.7 mmol/L即DM大鼠模型構(gòu)建成功;建模后第10天,所有大鼠以20%烏拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉,而后在其背部距肩胛骨下2 cm處用手術(shù)剪剪毛3 cm×3 cm,并用8%硫酸鈉脫凈殘留毛發(fā),75%乙醇消毒處理,各組大鼠用直徑為2.5 cm的圓形燙傷儀探頭燙傷脫毛區(qū)皮膚,形成緊鄰筋膜的全層皮膚缺損圓形創(chuàng)面,并即刻皮下注射醋酸氫化可的松0.6 mg/kg,另腹腔注射乳酸林格氏液 5 ml 抗休克。燙傷后當(dāng)天分組給藥:對照組、模型組不進(jìn)行藥物干預(yù),使用生理鹽水清洗創(chuàng)口,醫(yī)用無菌紗布覆蓋;TGF-β1組燙傷創(chuàng)面下注射TGF-β1(5 ng/ml)0.5 ml;實(shí)驗(yàn)組涂抹rb-bFGF,醫(yī)用無菌紗布覆蓋傷口。模型組、TGF-β1組、實(shí)驗(yàn)組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程均有傷亡2~3只,每組隨機(jī)選取22只作為觀察對象。造模成功后,每周隨機(jī)檢測血糖1次,尾靜脈每3天補(bǔ)充注射STZ 5 mg/kg,將大鼠血糖控制在16.7~22.0 mmol/L內(nèi),防止在實(shí)驗(yàn)過程中大鼠因血糖過高而死亡;燙傷后第28天清晨處死大鼠取創(chuàng)面組織標(biāo)本放入-20℃冰箱中保存,進(jìn)行病理學(xué)檢測。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 手術(shù)創(chuàng)面愈合情況:燙傷后第5、14、28天,以數(shù)碼相機(jī)拍照并記錄創(chuàng)面的愈合情況,包括創(chuàng)面顏色及質(zhì)地、腫脹程度、新生上皮覆蓋、有無滲出等。采用HVviewing8.0圖像分析軟件測定潰瘍創(chuàng)面面積,計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(初始創(chuàng)面面積-尚未愈合創(chuàng)面面積)/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.3.2 創(chuàng)面組織生態(tài)學(xué)變化:取每組大鼠30%創(chuàng)面組織,用5%甲醛固定,依照常規(guī)方法制成創(chuàng)面組織切片,HE染色,二甲苯處理,切片透明后,使用顯微鏡觀察創(chuàng)面組織的生態(tài)學(xué)變化,包括毛細(xì)血管生長分布、膠原蛋白及上皮組織再生、炎性細(xì)胞浸潤等情況。

1.3.3 超微病理結(jié)構(gòu):取每組大鼠50%創(chuàng)面組織,用30%聚甲醛和0.05%鋨酸將其固定1 h,無菌脫水5 min,置于預(yù)冷4℃乙醇3 min,環(huán)氧樹脂812浸透5 min,石蠟包埋,醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛進(jìn)行雙重染色,制成50 nm厚切片, 完全干燥后載于銅網(wǎng)上,透射電鏡觀察超微病理結(jié)構(gòu)。

1.3.4 α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)檢測:取每組大鼠10%創(chuàng)面組織,10%多聚甲醛固定,石蠟包埋并切片,按照免疫熒光試劑盒要求進(jìn)行操作。在熒光顯微鏡下,有紅色熒光表示α-SMA表達(dá),藍(lán)色熒光為細(xì)胞核染色,使用計(jì)算機(jī)采集熒光圖像,Image J軟件重疊紅綠熒光,將合成熒光的紅、藍(lán)色熒光光密度比值作為熒光強(qiáng)度值,隨機(jī)選取6個高倍視野計(jì)算樣品的平均熒光強(qiáng)度值。

1.3.5 TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)檢測:采用蛋白免疫印跡Western-blot法檢測。取每組大鼠10%創(chuàng)面組織,提取目標(biāo)蛋白樣品,經(jīng)BCA試劑盒測定蛋白濃度后,準(zhǔn)確量取50 μg,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),將樣品蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF轉(zhuǎn)膜上,加入10%脫脂奶粉封閉3 h,將一抗以1∶1 500比例稀釋后,維持4℃過夜孵育,洗滌加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗孵育3 h, 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ELC顯色30 min,經(jīng)曝光、顯影、定影后,以GAPDH為內(nèi)參來表示蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠創(chuàng)面愈合情況比較 各組大鼠手術(shù)后創(chuàng)口均無明顯感染,隨時(shí)間推移,大鼠創(chuàng)面逐步愈合。在燙傷28 d后對照組大鼠創(chuàng)面基本愈合;模型組大鼠創(chuàng)面顏色較深,周圍組織出現(xiàn)部分水腫,已經(jīng)好轉(zhuǎn);TGF-β1組創(chuàng)面明顯縮小;實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面很小,已有少部分開始愈合。 與對照組比較, 模型組創(chuàng)面愈合率明顯降低(P<0.05);與模型組比較,TGF-β1組、實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合率明顯升高(P<0.05),但2組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1、圖1。

2.2 各組創(chuàng)面組織生態(tài)學(xué)變化比較 對照組創(chuàng)口面新生膠原纖維增多,成纖維細(xì)胞團(tuán)狀排列,少量出現(xiàn)新生毛細(xì)血管。模型組炎性細(xì)胞明顯增多,成纖維細(xì)胞排列紊亂,未見新生毛細(xì)血管。TGF-β1組少量淋巴細(xì)胞出現(xiàn),但成纖維細(xì)胞致密分布在毛細(xì)血管周圍,新生毛細(xì)血管少量出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)組中成纖維細(xì)胞肥大,且密集分布,膠原纖維清晰可見,新生毛細(xì)血管呈小圓狀,并且已有開始生長的趨勢,見圖2。

2.3 各組創(chuàng)面組織超微結(jié)構(gòu)比較 對照組大鼠細(xì)胞器數(shù)量多,細(xì)胞核質(zhì)界限分明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量多,成纖維細(xì)胞數(shù)量多,新生膠原纖維較多;與對照組比較,模型組細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開始擴(kuò)張,線粒體空泡,核質(zhì)間隙不清晰;與模型組比較,TGF-β1組病理改變明顯減輕,其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基本不擴(kuò)張,細(xì)胞器數(shù)量豐富,新生膠原纖維較多;實(shí)驗(yàn)組與TGF-β1組相似,細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量豐富,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張不明顯,核質(zhì)間隙清晰,新生膠原纖維較多,見圖3。

2.4 各組α-SMA蛋白質(zhì)表達(dá)比較 燙傷后28 d,與對照組比較,模型組大鼠創(chuàng)面組織α-SMA蛋白表達(dá)明顯降低 (t=8.643,P=0.000);與模型組比較,TGF-β1組和實(shí)驗(yàn)組α-SMA蛋白表達(dá)均升高(F=15.392,P=0.000),但2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖4、圖5。

2.5 各組TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)比較 Western-blot檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.632、9.493,P=0.002、0.000);與模型組比較,TGF-β1組、實(shí)驗(yàn)組TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=16.283、28.832,P均=0.000),但2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖6。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較

注:與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05

圖1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合情況

圖2 各組大鼠創(chuàng)面的組織生態(tài)學(xué)變化(HE染色,×800)

圖3 各組大鼠造模后第28天后創(chuàng)面組織超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(×1 500)

圖4 各組大鼠創(chuàng)面組織α-SMA蛋白表達(dá)比較(×400)

3 討 論

糖尿病皮膚病變是多因素、多環(huán)節(jié)參與,涉及表皮、皮下細(xì)胞及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等的病理過程[7]。由于治療困難、反復(fù)不愈,目前有25%患者面臨截肢風(fēng)險(xiǎn),是糖尿病患者致殘的最大因素[8],嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。糖尿病患者因病變部位血液循環(huán)不暢,白細(xì)胞作用失常,傷口容易感染,且高血糖等特點(diǎn)加重傷口初期的炎性反應(yīng),影響膠原蛋白合成,傷口愈合受阻[9-10]。

注:與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較, bP<0.05

注:與對照組比較,aP<0.05;與模型組比較, bP<0.05

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[11],rb-bFGF治療糖尿病創(chuàng)面,可以改善血液微循環(huán),促進(jìn)創(chuàng)面愈合。另有研究證明[12],rb-bFGF能夠促進(jìn)創(chuàng)面上皮組織再生,促進(jìn)創(chuàng)面毛細(xì)血管新生。本研究構(gòu)建大鼠糖尿病皮膚燒傷模型,通過HE染色及透射電鏡觀察術(shù)后創(chuàng)面組織的病理學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)變化,研究rb-bFGF對糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,表皮生長因子和rb-bFGF均有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用;TGF-β1組和實(shí)驗(yàn)組在顯微鏡下均可見毛細(xì)管新生、大量成纖維細(xì)胞,與模型組比較,rb-bFGF能提高糖尿病皮膚創(chuàng)面的愈合率(P<0.05)。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的重要標(biāo)志物,在創(chuàng)面愈合過程中血管生成發(fā)揮著重要的作用[13]。創(chuàng)面?zhèn)诘挠闲迯?fù)過程往往伴隨傷口部位的收縮和瘢痕的形成,而肌成纖維細(xì)胞是形成傷口收縮的動力,α-SMA是導(dǎo)致傷口瘢痕收縮的基礎(chǔ),也是決定瘢痕最終結(jié)局的關(guān)鍵[14]。α-SMA的數(shù)量可以直接反映肌成纖維細(xì)胞的增殖狀態(tài),同時(shí)也是肌成纖維細(xì)胞中的特異性蛋白,與瘢痕的收縮功能相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組中α-SMA表達(dá)量明顯降低,rb-bFGF治療后,α-SMA表達(dá)明顯升高,其表達(dá)水平與TGF-β1組相近,說明rb-bFGF可通過促進(jìn)血管生成達(dá)到治療糖尿病皮膚創(chuàng)面愈合的療效。

已有研究證明,導(dǎo)致糖尿病皮膚病變難愈的原因較為復(fù)雜,信號通路表達(dá)的變化是其中重要的因素之一。有報(bào)道稱[16],激活創(chuàng)面TGF-β1/Smad3信號通路,可促進(jìn)上皮新生組織生成,加速傷口愈合。研究顯示[17],TGF-β1/Smad3信號通路是創(chuàng)面愈合的重要調(diào)控途徑,TGF-β1是促進(jìn)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化因子,能夠促進(jìn)上皮組織生成,加速組織修復(fù)。Smad3蛋白主要促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)靶基因的表達(dá),增強(qiáng)α-SMA的表達(dá)水平[18]。此外,Smad3蛋白還可加速細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)增生分化,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定從而加速創(chuàng)面組織纖維化,促進(jìn)平滑肌生長,多環(huán)節(jié)治療難愈合創(chuàng)面;使創(chuàng)面組織短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞增生與遷移期,起到更好的抗炎、消腫作用[19]。本研究基于TGF-β1/Smad3信號通路探討rb-bFGF促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,糖尿病創(chuàng)面模型大鼠經(jīng)rb-bFGF治療后,通路蛋白磷酸化水平均明顯升高,提示rb-bFGF可能通過激活TGF-β1/Smad3通路,增強(qiáng)α-SMA蛋白的表達(dá),促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本研究不足之處在于:(1)研究中通過燙傷皮膚構(gòu)建糖尿病大鼠皮膚病變模型,其病理生理?xiàng)l件與糖尿病內(nèi)源性皮膚病變模型存在不同之處,可能影響結(jié)論的準(zhǔn)確性;(2)研究中評價(jià)了病理改變及通路調(diào)節(jié)機(jī)制,其不良反應(yīng)的影響未深入探討;(3)影響糖尿病皮膚病變的通路較多,rb-bFGF是否還能通過調(diào)節(jié)其他通路來影響疾病進(jìn)程,仍需進(jìn)一步的研究。

綜上所述,rb-bFGF可促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的愈合,其作用機(jī)制可能與TGF-β1/Smad3信號通路激活有關(guān)。

利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張萍:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;蔣仕秋:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;陳雪蓮、王寬:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉漪淪:課題設(shè)計(jì)

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