張雪靜，牛世偉，朱利民

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

乳腺癌已成為威脅廣大女性身心健康的常見(jiàn)腫瘤疾病之一。臨床實(shí)踐表明化學(xué)療法是治療癌癥的主要方法，然而由于化療藥物自身存在水溶性差、生物利用度低等問(wèn)題，限制了化學(xué)療法的應(yīng)用[1-4]。眾所周知，開(kāi)發(fā)新型癌癥治療藥物成本高、周期長(zhǎng)且面臨較大風(fēng)險(xiǎn)，因此基于現(xiàn)有藥物研制新型傳輸系統(tǒng)成為首選方案。新型遞送系統(tǒng)普遍具備優(yōu)異的穩(wěn)定性和良好的生物相容性[5]，并且可以很好地利用腫瘤部位的增強(qiáng)滲透和滯留(enhanced permeability and retention, EPR)效應(yīng)。文獻(xiàn)[6]研究指出，由于腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞表面的表達(dá)因子大有不同，因此可以通過(guò)在藥物遞送系統(tǒng)上添加特殊配體，利用配體靶向腫瘤細(xì)胞上的高表達(dá)因子，從而增加腫瘤組織對(duì)藥物的攝取，減少對(duì)正常組織的毒副作用。殼聚糖(chitosan, CS)具有良好的生物相容性，其在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，包括藥物和基因遞送、組織工程、傷口愈合和抗微生物劑等方面[7]。由于殼聚糖分子中存在氨基，其在酸性環(huán)境中質(zhì)子化后促使電荷發(fā)生轉(zhuǎn)變，使得殼聚糖本身具有pH敏感特性，可在腫瘤內(nèi)環(huán)境中產(chǎn)生響應(yīng)[8-9]。二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)可生物降解，且在低臨界溫度時(shí)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，形成非均勻狀濁液，是一種較好的溫敏性材料[10-11]。將DEGMA接枝到殼聚糖上，由于殼聚糖是兩親性材料，其在水相中可以自組裝成納米顆粒，疏水性藥物將被裝載于納米顆粒的內(nèi)核，而DEGMA則在納米顆粒的外層。當(dāng)納米顆粒進(jìn)入腫瘤環(huán)境后，由于溫度的升高，DEGMA的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，又由于殼聚糖的pH敏感性，納米顆粒發(fā)生裂解，藥物得以釋放。紫杉醇(paclitaxel, PTX)作為萜類(lèi)復(fù)雜的次生代謝物，是一種廣譜高效的抗腫瘤藥物，其可以在細(xì)胞分裂過(guò)程中通過(guò)穩(wěn)定微管抑制細(xì)胞的解聚，致使腫瘤細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗癌作用。紫杉醇由于具有其獨(dú)特且新穎的作用機(jī)制以及效果顯著的抗癌特性而受到國(guó)內(nèi)外許多藥理學(xué)家和生物學(xué)家的青睞[12-15]?；谏鲜鲅芯?，本文設(shè)計(jì)了DEGMA接枝的pH和溫度敏感的殼聚糖聚合物。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料

殼聚糖(脫乙酰度>90%)、乙酸酐、乙二酸、乙醚、丙酮，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、4-(N，N-二甲基氨基)吡啶(DMAP)、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸(DDACT)、二聚乙二醇單甲醚甲基丙烯酸甲酯(DEGMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、紫杉醇(PTX)，購(gòu)于阿拉丁公司(中國(guó)上海)；透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500)；超純水。

1.2 儀器設(shè)備

Avance 400型核磁共振譜儀，瑞士Bruker公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本JOEL公司；BI-200SM型動(dòng)態(tài)光散射儀，美國(guó)Brookhaven公司；LC-20AT型高效液相色譜儀，日本Shimadu公司；LAMBDA 35型紫外分光光度計(jì)，美國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乙?；瘹ぞ厶堑闹苽?/p>

取5 g殼聚糖溶于一定濃度的醋酸溶液中，室溫下磁力攪拌使殼聚糖完全溶解，然后加入250 mL無(wú)水乙醇攪拌至澄清，再加入0.5 mL乙酸酐，密封容器室溫下磁力攪拌一段時(shí)間至溶液澄清。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH使殼聚糖完全析出，將析出的殼聚糖過(guò)濾，冷凍干燥后取出研磨成均勻細(xì)小的粉末，即乙?；臍ぞ厶?N-CS)。

1.3.2 殼聚糖大分子鏈轉(zhuǎn)移劑的制備

取0.292 g乙?；臍ぞ厶侨苡?0 mL DMF中，在DCC(0.205 g)和DMAP(0.015 g)存在的條件下，將0.37 g鏈轉(zhuǎn)移劑DDACT緩慢加入其中，室溫下磁力攪拌約40 h，之后將反應(yīng)物加入冰水中放入透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500)中透析3 d，第1 d每2 h換一次水，第2 d每4 h換一次水，第3 d每8 h 換一次水。將透析后的沉淀物冷凍干燥，得到淡黃色殼聚糖大分子鏈轉(zhuǎn)移(N-CS-RAFT)試劑。

1.3.3 乙?；瘹ぞ厶堑慕又Ω男?/p>

取0.046 8 g N-CS-RAFT溶于5 mL DMF中，在氮?dú)夥諊Ｗo(hù)下磁力攪拌約4 h至完全溶解；再加入0.003 2 g引發(fā)劑AIBN和1 g DEGMA，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于40 ℃油浴中磁力攪拌24 h。反應(yīng)結(jié)束后加入10倍體積的冰乙醚置入冰箱沉淀12 h，去除乙醚收集沉淀，將沉淀放入透析袋透析3 d，透析后的沉淀放入40 ℃真空干燥箱直至完全干燥，即可得到N-CS-g-PDEGMA聚合物。最后將獲得的N-CS-g-PDEGMA納米顆粒溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的醋酸溶液中，攪拌24 h水解去掉N-乙?；?，冷凍干燥得到CS-g-PDEGMA。

1.3.4 CS-g-PDEGMA的載藥及釋藥

取20 mg CS-g-PDEGMA溶解于水中，取5 mg PTX溶解于乙醇中，將溶解的PTX緩慢滴入CS-g-PDEGMA溶液中超聲振蕩30 min，在室溫下反應(yīng)24 h后用截留相對(duì)分子質(zhì)量為3 500的透析袋室溫下透析3 d以去除小分子雜質(zhì)和未包封的藥物，透析后的溶液以6 000 r/min的速度離心30 min，冷凍干燥得到CS-g-PDEGMA/PTX粉末。

取CS-g-PDEGMA/PTX溶于超純水，完全溶解后用高速離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，離心時(shí)間為30 min。收集離心后的上清液，用商效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)法測(cè)定上清液中紫杉醇的含量。包封率和載藥率分別根據(jù)式(1)和(2)計(jì)算，得到包封率為73%，載藥率為12.1%。

(1)

(2)

式中：Ee為包封率，%；Ed為載藥率，%；mp為PTX的質(zhì)量，mg；ms為上清液中的PTX質(zhì)量，mg；m為載藥納米顆粒的總質(zhì)量，mg。

取5 mg CS-g-PDEGMA/PTX溶于1 mL磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline, PBS)溶液中，待其充分溶解后，分別取50 μL置于兩個(gè)微量透析管中，將其懸浮于離心管內(nèi)，離心管中分別加入pH值為7.4和5.0的PBS溶液各20 mL，將離心管置于37 ℃水浴振蕩器中，振蕩頻率為100次/min，定時(shí)取1 mL樣品；或者，分別取50 μL置于兩個(gè)微量透析管中，將其懸浮于離心管內(nèi)，在離心管中加入pH值為7.4的PBS溶液，分別將其置于25和37 ℃水浴振蕩器中，振蕩頻率為100次/min，定時(shí)取1 mL樣品，取樣后再補(bǔ)充1 mL預(yù)熱的PBS溶液。取出的樣品在高速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min，時(shí)間為30 min。用HPLC法測(cè)定上清液中的紫杉醇含量。整理數(shù)據(jù)后計(jì)算藥物釋放情況。

1.3.5 材料及載藥納米顆粒的表征

CS-g-PDEGMA的結(jié)構(gòu)表征。取5 mg CS-g-PDEGMA樣品溶于0.5 mL的氘代二甲基亞砜中，用Avance 400型核磁共振波譜儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)試分析。

CS-g-PDEGMA聚合物的低臨界溶解溫度(lower critical solution temperature, LCST)測(cè)定。取CS-g-PDEGMA溶液對(duì)其進(jìn)行稀釋，用LAMBDA 35型紫外分光光度計(jì)測(cè)其LCST，設(shè)置升溫溫度區(qū)間為20～60 ℃。

CS-g-PDEGMA/PTX的形貌表征。取1 mg CS-g-PDEGMA/PTX樣品溶于2 mL超純水中配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的溶液，濾膜過(guò)濾后取一滴CS-g-PDEGMA/PTX溶液滴到銅網(wǎng)上，自然晾干后于JEM-2100型透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)。

CS-g-PDEGM/PTX的粒徑測(cè)定。使用BI-200SM型動(dòng)態(tài)光散射儀對(duì)CS-g-PDEGMA/PTX的形貌表征時(shí)經(jīng)濾膜過(guò)濾的溶液進(jìn)行測(cè)試。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 核磁共振氫譜分析

CS-g-PDEGMA的核磁共振圖譜(1H-NMR，400 MHz，DMSO)如圖1所示。由圖1可以看出：在化學(xué)位移1.2～3.0(c～a)處是殼聚糖RAFT試劑的特征峰帶，表明殼聚糖RAFT試劑已成功制備；在化學(xué)位移4.2附近(b)處出現(xiàn)了PDEGMA主鏈上氫的特征峰，表明DEGMA已經(jīng)成功接枝；在化學(xué)位移5.6～6.2處是殼聚糖上—CH—的特征峰；在化學(xué)位移3.0～4.0處是溶劑氘代二甲基亞砜的特征峰。以上特征峰的出現(xiàn)表明已成功制備出CS-g-PDEGMA。

2.2 CS-g-PDEGM的溫敏特性

DEGMA和其他溫敏性材料一樣都是具有LCST的聚合物，其中LCST是指溫敏聚合物達(dá)到溶液最大吸光度50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度值。CS-g-PDEGMA水溶液的吸光度曲線如圖2所示。由圖2可以看出：接枝共聚物CS-g-PDEGMA在27～37 ℃ 發(fā)生了明顯的相變，直到39 ℃相變依然存在，其LCST值約為33 ℃，表明所制備的聚合物具有很好的溫度響應(yīng)性。

2.3 CS-g-PDEGM/PTX形貌及粒徑分析

CS-g-PDEGMA/PTX的透射電鏡圖及其粒徑分布如圖3所示。由圖3可以看出，CS-g-PDEGMA/PTX聚合物分散良好，基本呈球形。由TEM圖計(jì)算得聚合物顆粒的平均粒徑為(130.0±12.6)nm，而由動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)得的粒徑結(jié)果顯示，聚合物顆粒的平均粒徑為(180.0±17.4)nm且分布均勻，其測(cè)得的粒徑比由TEM計(jì)算得出的粒徑值略大。這是因?yàn)門(mén)EM檢測(cè)樣本在制備過(guò)程中會(huì)脫水，導(dǎo)致粒徑減小。

Fig.3 TEM image and particle size distributionof CS-g-PDEGMA/PTX

2.4 紫杉醇的體外釋放

PTX在不同pH值和溫度下的釋放情況如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)溫度相同時(shí)，pH值為7.4時(shí)的PTX累計(jì)釋放率低于pH值為5.0時(shí)的釋放率，這是由pH敏感的納米顆粒在酸性環(huán)境下被降解所導(dǎo)致的。此外，初始階段藥物釋放較快，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PXT釋放速率逐漸降低。在48 h內(nèi)，當(dāng)pH值為5.0且溫度為37 ℃時(shí)，PTX累計(jì)釋放率最高只有46.6%，而在pH為5.0且溫度為39 ℃時(shí)PTX累計(jì)釋放率最高達(dá)70%。這是由于溫度從37 ℃增加到39 ℃時(shí)，DEGMA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致納米顆粒的結(jié)構(gòu)坍塌，進(jìn)而導(dǎo)致PTX釋放率增加，表明CS-g-PDEGMA/PTX納米顆粒具有溫度響應(yīng)特性，即隨溫度的升高累積釋放率升高。由此可見(jiàn)，CS-g-PDEGMA/PTX納米載藥系統(tǒng)能很好地響應(yīng)腫瘤微環(huán)境進(jìn)而控制藥物釋放。

3 結(jié) 語(yǔ)

本文利用RAFT聚合法合成了加載PTX并接枝DEGMA的pH和溫度敏感殼聚糖聚合物。核磁共振氫譜表明該聚合物已成功制備；透射電子顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射儀表征結(jié)果顯示制備的殼聚糖聚合物呈球形，粒徑呈正態(tài)分布且分散良好；紫外分光光度計(jì)測(cè)試結(jié)果顯示該納米顆粒的LCST為33 ℃；載藥試驗(yàn)和體外藥物釋放研究表明，該殼聚糖聚合物的載藥率為12.1%，包封率為73%，并且具pH和溫度響應(yīng)性和緩釋效果。