楊延波，謝曉田，張雪靜，鄭永利，朱利民

(東華大學(xué) a. 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院； b. 東華大學(xué)-倫敦都市大學(xué)中英藥用紡織品聯(lián)合實驗室，上海 201620)

二維過渡金屬二硫化物(TMDCs)納米材料由于其獨特的電子特性、高比表面積和高吸光度，引起學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。MoS2納米片作為TMDCs的典型代表，具有高NIR(近紅外，700～1 100 nm)吸光度和低毒性，成為下一代光熱轉(zhuǎn)換材料的最佳選擇[2]。特別是其組成元素Mo是細胞中幾種酶的必需微量元素，S是一種常見的生物元素[3]，因此MoS2是一種可用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的出色材料。然而，由于MoS2的表面能較高，納米片在數(shù)量較多時往往不可避免地重新堆積和聚集，這極大地限制了其應(yīng)用[3]。此外，目前制備的MoS2納米片的膠體穩(wěn)定性不理想[4-7]，而這對于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用至關(guān)重要。因此，基于MoS2的靶向藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用受到限制。

在前期的研究工作中發(fā)現(xiàn)，功能化的MoS2納米片可以將化學(xué)療法和光熱療法相互組合，從而用于靶向藥物遞送，但協(xié)同治療效果有待加強[8]。黑色素是人體內(nèi)源性生物色素，具有固有的光學(xué)吸收能力，主要存在于皮膚、毛囊和眼睛中，基于黑色素的納米平臺在診斷成像和光熱療法中展現(xiàn)出巨大的前景。Zhang等[9]報道了一種基于黑色素(Mel)的納米脂質(zhì)體診斷治療系統(tǒng)，其具有理想的光熱轉(zhuǎn)換效率、治療性能和生物安全性，可以實現(xiàn)乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤的完全根除?；诤谏氐募{米粒子可用作光聲成像(PAI)和磁共振成像(MRI)的多功能造影劑，具有理想的生物安全性和較低的副作用。

本文基于單層MoS2納米片設(shè)計了一種納米復(fù)合物，其由聚乙烯亞胺(PEI)連接透明質(zhì)酸(HA)，同時用聚乙二醇(SH-PEG)修飾MoS2納米片，最終制成HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG(簡稱HPMP)納米載體，其可用于遞送并在pH、NIR雙重刺激響應(yīng)下釋放化療藥物鹽酸阿霉素(DOX)，將DOX和光熱劑MoS2、Mel相結(jié)合可應(yīng)用于腫瘤的化療-光熱協(xié)同治療。

1 試驗部分

1.1 原材料及試劑

透明質(zhì)酸(Mw=0.5 kDa)，購自天津希恩思奧普德科技有限公司；黑色素，購自北京科瑞邁科技有限公司；聚乙二醇(SH-PEG，Mw=2 kDa)，購自上海湃閣恩貿(mào)易經(jīng)營部；聚乙烯亞胺、鹽酸阿霉素、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；α-硫辛酸(LA)、己烷中的n-BuLi溶液(2.4 M)，購自阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖鹽(PBS)溶液，購自Sigma-Aldrich；其他材料和透析袋均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。試驗中所用的藥品均為分析純，試驗中所用的水均為Milli-Q Plus 185凈水系統(tǒng)純化所得超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 MoS2納米片的制備[10]

將0.3 g鉬酸鈉和0.6 g硫代乙酰胺分散在30 mL水中，超聲15 min后磁力攪拌至完全溶解。在220 ℃反應(yīng)釜中反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后離心，用去離子水洗滌3次，冷凍干燥收集黑色沉淀物得到MoS2納米片。

1.2.2 PEI-LA-MoS2-SH-PEG(簡稱PMP)的制備[11]

將300 mg PEI溶解在超純水中，用稀鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH至中性，將82.4 mg LA溶解在20 mL乙腈溶液中，之后將191.7 mg EDC和115.1 mg NHS加入到溶解LA的乙腈溶液中，攪拌均勻后，加入到PEI溶液中攪拌過夜，然后將溶液透析、冷凍干燥得到LA-PEI。將30 mg LA-PEI加入到10 mL質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的MoS2分散液中，超聲30 min后攪拌過夜，然后離心，用蒸餾水洗滌沉淀3次，透析、冷凍干燥得到PEI-LA-MoS2(PM)。取3 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的PEI-LA-MoS2溶液加入15 mg SH-PEG，超聲30 min，然后磁力攪拌12 h，制備得到PMP。

1.2.3 HPMP的制備

將30 mg HA溶解于15 mL超純水，再加入10 mL質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL的EDC溶液，超聲15 min，再分別加入10 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的EDC溶液、15 mL質(zhì)量濃度為2 mg/mL且pH=8.5的NHS水溶液。將上述所制溶液在室溫下攪拌2 h，后加入15 mg PMP，攪拌過夜，然后離心，冷凍干燥得到HPMP。

1.2.4 HPMP的載藥能力和藥物釋放研究

將HPMP與模型藥物DOX按不同比例在pH=7.4的PBS溶液中混合，攪拌過夜。離心收集上層清液，通過紫外分光光度計測試其載藥能力。預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DOX與HPMP的質(zhì)量比為1∶1時，載體的載藥能力最強，1 g HPMP能負載812.5 mg DOX。

將質(zhì)量比為1∶1的HPMP與DOX在pH=7.4的PBS溶液中混合，攪拌過夜，離心凍干收集沉淀。稱取3 mg載藥載體分散在3 mL不同pH值的PBS溶液中，然后置于透析袋(截留相對分子質(zhì)量為6 000)中透析，透析袋外部為50 mL對應(yīng)pH值的PBS溶液，每間隔一定的時間取透析袋外部液體1 mL，測溶液在波長480 nm 處的紫外吸收并補充透析袋外部液體使之保持不變。載藥效率(η)按式(1)計算。

(1)

1.3 材料表征

使用日本JEOL公司的JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM)觀察制備的MoS2的形貌。使用美國布魯克海文儀器公司的BI-200 SM型靜態(tài)光散射儀對MoS2、 HPMP進行水動力學(xué)直徑(DLS)測試。使用美國Nicolet公司Nexus-670型傅里葉紅外光譜儀(FTIR)對PEI-LA-MoS2(簡稱PM)、PMP、HPMP進行測試分析，波數(shù)為600～4 000 cm-1，間隔為2 cm-1。使用英國的馬爾文Malvern Zetasizer Nano ZS 90型納米粒度電位儀對MoS2納米片、PM、 PMP、 HA和HPMP的Zeta電位變化進行測量。使用UV 3600型紫外可見分光光度計對載藥前后的HPMP以及DOX進行測試。

2 結(jié)果與討論

2.1 MoS2及其復(fù)合物的表征

2.1.1 TEM及DLS分析

將制備的MoS2納米片重新分散在水溶液中，超聲使其均勻分散，通過TEM觀察所制備的MoS2納米片的形狀，如圖1所示。從圖1中可觀察到均勻分散的MoS2片狀結(jié)構(gòu)，平均粒徑為80 nm。這與DLS測試的MoS2水溶液的水動力學(xué)直徑一致，這個粒徑大小有利于腫瘤細胞通過內(nèi)吞途徑對載藥納米復(fù)合物進行攝取[12]。

將SH-PEG修飾在單層MoS2納米片表面，進一步接枝PEI并用HA修飾以后，納米復(fù)合物的水動力學(xué)直徑從大約80 nm升高至104 nm左右，這一粒徑使得HPMP納米復(fù)合物的靜脈注射給藥或通過EPR(electron paramangnetic resonance)效應(yīng)使得藥物被動積累在腫瘤部位成為可能[13]。

2.1.2 紅外光譜分析

采用壓片法對PM、 PMP、 HPMP進行紅外光譜分析，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，PM紅外譜圖的2 924 cm-1處有飽和C—H特征峰，這表明PEI分子成功接枝在MoS2納米片上，1 698 cm-1處有—CONH—特征峰，說明LA與PEI通過酰胺鍵成功連接。在PMP紅外譜圖中1 340、 1 096 cm-1處有CH3的對稱變形振動峰以及C—O鍵的伸縮振動峰，說明SH-PEG分子已成功修飾MoS2納米片。HPMP的紅外譜圖中3 283 cm-1處的特征峰歸因于HA中C—H鍵的伸縮振動峰。由此可見，材料HPMP已成功制備。

2.1.3 Zeta電位分析

MoS2納米片、PM、 PMP、 HA和HPMP的Zeta電位變化如圖3所示。由圖3可知，MoS2納米片的電勢是-24 mV，經(jīng)LA-PEI修飾后，電勢從負值(-24 mV)變?yōu)榱苏?+6 mV)，說明PM已經(jīng)成功制備。然后用SH-PEG來修飾所制備的PM以改善納米復(fù)合物的膠體穩(wěn)定性，電勢從正值(+6 mV)進一步變?yōu)樨撝?-14 mV)，說明SH-PEG已成功加載在納米復(fù)合物PM上，從而制成PMP。最后，用靶向分子透明質(zhì)酸HA來修飾PMP，以使該藥物遞送系統(tǒng)具有主動靶向腫瘤部位的能力，PMP的電勢從-14 mV變?yōu)?23 mV，表明靶向分子HA已在其上成功聚合。

2.1.4 穩(wěn)定性分析

將所制備的無SH-PEG修飾的PM和SH-PEG及HA修飾的HPMP分別配成20 mL水溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/mL)放置在室溫下，分別在1、 24 h后觀察兩種溶液的變化情況，如圖4所示。由圖4可以看出，放置1 h后，PM和HPMP溶液都沒有出現(xiàn)明顯的集聚現(xiàn)象，但經(jīng)過24 h后，無SH-PEG修飾的PM溶液出現(xiàn)明顯的集聚現(xiàn)象，而經(jīng)SH-PEG修飾的HPMP溶液分散均勻，顯示出更高的膠體穩(wěn)定性，可以較好地分散在水中而無任何附聚。

2.2 納米復(fù)合物的光熱效果測試

2.2.1 加載黑色素的影響

載藥納米復(fù)合物HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG@DOX(簡稱HPMP@DOX)與黑色素按照5∶1的質(zhì)量比混合，得到HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG@(DOX/Mel)(簡稱HPMP@DOX/Mel)，其和無黑色素的載體HPMP@DOX光熱效果的對比如圖5所示。由圖5可知，對于HPMP@DOX，在600 s內(nèi)其水溶液(質(zhì)量濃度為1 mg/mL，功率密度為1 W/cm2) 的溫度從25 ℃升高至44 ℃，而在相同條件下，加載黑色素的載體HPMP@DOX/Mel的溫度從25 ℃升高至56 ℃。由此表明，黑色素的加載顯著提高了納米復(fù)合材料的光熱效果，使其具有應(yīng)用于腫瘤細胞化療-光熱治療協(xié)同治療的潛力。

2.2.2 質(zhì)量濃度和暴露時間的影響

將不同質(zhì)量濃度的HPMP@DOX/Mel復(fù)合物的懸浮液暴露于808 nm激光(功率密度為1.0 W/cm2)中，并將純凈水作為對照樣，試樣的光熱效果如圖6所示。由圖6可知，隨著質(zhì)量濃度和暴露時間的增加，HPMP@DOX/Mel水分散體的溫度明顯升高，表明所制備的納米復(fù)合物的光熱效果具有濃度依賴性。當(dāng)HPMP@DOX/Mel納米復(fù)合材料的質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時，溶液溫度可在300 s內(nèi)達到52 ℃，從而證實HPMP@DOX/Mel納米復(fù)合材料具有良好的光熱效果。

2.2.3 激光照射強度的影響

HPMP@DOX/Mel質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，不同激光照射強度下的光熱效果如圖7所示。由圖7可知，相同質(zhì)量濃度下，激光照射強度越大，溫度升高幅度越大。當(dāng)激光照射功率密度為0.5 W/cm2時，300 s內(nèi)HPMP@DOX/Mel水溶液的溫度從25 ℃升高至35 ℃；而當(dāng)激光照射功率密度為1.5 W/cm2時，300 s內(nèi)其水溶液的溫度從25 ℃升高至68 ℃。由此表明，所制備的納米復(fù)合物HPMP@DOX/Mel的光熱效果具有激光功率依賴性。

2.2.4 NIR激光循環(huán)的影響

在NIR激光照射下，4次開、關(guān)循環(huán)對HPMP@DOX/Mel溶液溫度的影響如圖8所示，其中，NIR激光照射功率密度為1.0 W/cm2，HPMP@DOX/Mel質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，體積為1 mL。

由圖8可知，經(jīng)過4次循環(huán)后，在溫度-時間曲線中未觀察到明顯的溫度衰減，這意味著HPMP@DOX/Mel納米復(fù)合材料具有優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性，適用于腫瘤的光熱消融。

2.3 HPMP的載藥及體外藥物釋放研究

2.3.1 紫外光譜分析

對載藥前后載體HPMP和DOX的紫外光譜進行分析，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，單獨的阿霉素DOX在480 nm處有明顯的吸收峰，而載藥后的納米復(fù)合物HPMP@DOX的紫外吸收光譜在480 nm處也出現(xiàn)了明顯的吸收峰。由此表明，化療藥物阿霉素DOX已成功加載于納米復(fù)合物HPMP上。

2.3.2 藥物的體外釋放測試

在pH值為7.4的條件下研究了DOX與HPMP藥物上載的最佳質(zhì)量比，結(jié)果如表1所示。由表1可知，最大載藥效率為81.25%，即當(dāng)納米復(fù)合材料HPMP與DOX以1∶1的質(zhì)量比混合時，載藥效率達到最大值，在1 g HPMP上可負載約812.5 mg DOX。

表1 與DOX以不同比例混合的HPMP的載藥量

在有無NIR激光照射和不同pH值的PBS溶液中，研究體外控制的藥物釋放隨時間的變化，結(jié)果如圖10所示，其中，NIR激光照射功率密度為1.5 W/cm2，波長為808 nm。

由圖10可知，藥物釋放1 h后，在pH值為7.4、沒有NIR激光照射時，從HPMP@DOX中釋放的DOX小于5%。然而，在pH值為5.0且沒有NIR激光照射時，1 h后DOX的釋放超過12%。這可能歸因于在弱酸性條件下DOX與納米復(fù)合材料HPMP的相互作用的減少，包括疏水相互作用和靜電相互作用，因此可以顯著加速DOX的釋放。在pH值為5.0且沒有NIR激光照射的情況下，6 h內(nèi)釋放約24.8%的DOX。當(dāng)存在NIR激光照射時，DOX釋放得更快，其在pH值為5.0時，6 h內(nèi)釋放量增加至31.6%。由此可見，NIR激光觸發(fā)的光熱效應(yīng)可以促進DOX的釋放，這可能歸因于MoS2納米片產(chǎn)生的高溫引起HPMP納米復(fù)合材料的振動，從而減少了DOX與之的相互作用。由于激光照射可以精確調(diào)節(jié)，因此pH/NIR多刺激響應(yīng)的HPMP@DOX可以應(yīng)用于癌癥的“按需”化療。

3 結(jié) 語

本文對單層MoS2進行修飾，在MoS2表面接枝了含有巰基的聚乙二醇，以聚乙烯亞胺為連接臂接枝透明質(zhì)酸，使其獲得更好的穩(wěn)定性、pH和近紅外光雙重刺激響應(yīng)性。此外，選用鹽酸阿霉素作為模型藥物研究了具有雙重響應(yīng)性的HA-PEI-LA-MoS2-SH-PEG的體外藥物釋放行為，結(jié)果顯示：這種雙重響應(yīng)性MoS2復(fù)合物在模擬腫瘤的弱酸性(pH≈5.0)環(huán)境下，擁有顯著增加的藥物釋放速率；在近紅外光的激光照射下也表現(xiàn)出更快的釋藥速率，表明載體具有較好的控釋效果。此外，載體表面新型的光熱劑黑色素的負載顯著提高了納米復(fù)合材料的光熱效果，表明其有應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以進行化療光熱協(xié)同治療的潛在價值。