石彩歌 黃士荷 張素粉 肖奇志 陳 興 王群慧 郭天棋

1.廣東省珠海市婦幼保健院婦科，廣東珠海 519001；2.廣東省珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東珠海 519001

研究表明，約99%的宮頸癌患者是由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染所致，這種病毒能夠通過(guò)密切接觸和性接觸傳播，并且能被人體長(zhǎng)期攜帶[1]。雖然大多數(shù)高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是一過(guò)性的，可被機(jī)體免疫系統(tǒng)清除，但仍有少部分婦女存在高危型HPV 持續(xù)感染，進(jìn)而導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞病變[2-3]。因此，有效的人體免疫體系對(duì)清除HPV 感染意義重大。本研究擬將TNF-β 的候選SNP rs909253、rs2239704和IFN-α 的候選SNP rs6475526 多態(tài)性作為宮頸病變分子分型指標(biāo)，為不同分期的宮頸病變自然轉(zhuǎn)歸提供基因分型的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)臨床治療和管理具有一定的指導(dǎo)意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收 集 本 院2018 年1 月～2019 年6 月 高 危型HPV 陽(yáng)性病例共236 例，年齡22 ～63 歲，平均（42.5±10.3）歲，根據(jù)病理確診CIN 級(jí)別分為病理正常組、CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組，每組分別45、48、47、50、46 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所選患者均因白帶異常、陰道流血、接觸性出血、宮頸炎等癥狀出現(xiàn)而就診；（2）所有病例均有性生活史，就診前一周內(nèi)未行陰道藥物治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理或細(xì)胞學(xué)確診為子宮炎癥、良性病變、繼發(fā)腫瘤及病情危重不能清晰回答問(wèn)題者。以高危型HPV-DNA 檢測(cè)陰性和病理組織細(xì)胞學(xué)檢測(cè)陰性的健康女性為對(duì)照組，年齡23 ～60 歲，平均（40.3±8.3）歲，排除妊娠期、宮頸上皮內(nèi)瘤變病史、腫瘤病史及盆腔放射史，共收集56 例標(biāo)本。各組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 樣本收集 （1）宮頸脫落細(xì)胞高危型HPV感染狀態(tài)的檢測(cè)按臨床常規(guī)檢測(cè)進(jìn)行：取材自宮頸脫落細(xì)胞，細(xì)胞保存液4℃保存，一周內(nèi)檢測(cè)并記錄結(jié)果。宮頸組織細(xì)胞病理檢查按常規(guī)送病理科檢測(cè)，登記檢測(cè)結(jié)果。（2）真空采血管收集病例組及對(duì)照組受試者靜脈血3mL，采用乙二胺四乙酸（EDTA-K2）抗凝，取其中的200μL，采用全血核酸提取試劑盒提取檢測(cè)對(duì)象外周血基因組DNA，于-20℃冰箱內(nèi)保存，剩余血液樣本凍存于-20℃。

1.2.2 檢測(cè)方法 （1）高危型HPV-DNA 檢測(cè)：選擇亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司檢測(cè)HPV-DNA 23 型試劑盒，按說(shuō)明書提取DNA，依照程序進(jìn)程基因擴(kuò)增，產(chǎn)物變性，并采用全自動(dòng)雜交儀進(jìn)行雜交，肉眼觀察結(jié)果。（2）宮頸組織細(xì)胞學(xué)檢測(cè)由臨床醫(yī)生陰道鏡下取樣，送病理科檢測(cè)并出具報(bào)告。（3）引物設(shè)計(jì)：針對(duì)TNF-β 的候選SNP rs909253、rs2239704 和IFN-a 的 候 選SNP rs6475526，從Genebank 查找SNP 所在人基因組序列，并用prime 5.0 設(shè)計(jì)擴(kuò)增和測(cè)序引物。由生物公司合成引物。（4）TNF-β、IFN-α 基因候選SNP 檢測(cè)摸索優(yōu)化條件應(yīng)用PCR 方法擴(kuò)增TNF-β、IFN-α 基因候選SNP 靶片段，采用Sanger 測(cè)序法對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確定SNP 等位基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)分析，首先檢驗(yàn)基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律的要求，基因型和等位基因頻數(shù)的分布差異采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組TNF-β（rs909253）基因型及等位基因頻率分布比較

與病理正常組及對(duì)照組比較，CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組TNF-β（rs909253）基因型分布頻率和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)表1 ～ 2。

表1 各組TNF-β（rs909253）基因型頻率分布比較[n（%）]

表2 各組TNF-β（rs909253）等位基因頻率分布比較[n（%）]

2.2 各組TNF-β（rs2239704）基因型及等位基因頻率分布比較

與病理正常組及對(duì)照組比較，CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組TNF-β（rs2239704）基因型分布頻率和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)表3 ～ 4。

表3 各組TNF-β（rs2239704）基因型分布比較[n（%）]

表4 各組TNF-β（rs2239704）等位基因頻率分布比較[n（%）]

2.3 各組IFN-α（rs6475526）基因型及等位基因頻率分布比較

與病理正常組及對(duì)照組比較，CIN Ⅰ組、CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組以及宮頸癌組IFN-a（rs6475526）基因型分布頻率和等位基因分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見(jiàn)表5 ～ 6。

2.4 TNF-β、IFN-α基因與宮頸HPV感染持續(xù)及復(fù)發(fā)的關(guān)系

病例組236 例患者中9 例失訪，平均隨訪時(shí)間8個(gè)月，發(fā)現(xiàn)HPV 再次檢出率為57.20%（135/236），HPV陰性后再次陽(yáng)性率為23.70%（32/135），經(jīng)Kaplan-Meier 法分析并繪制曲線后，隨訪期間CC、CT、TT基因型的累計(jì)HPV 陰性率有明顯差異（P ＜0.05），其中CC基因型攜帶者的HPV感染的累積陰性率最低，且該型攜帶者的預(yù)后更差，復(fù)發(fā)率更高。

表5 各組IFN-α（rs6475526）基因型頻率分布比較[n（%）]

表6 各組IFN-α（rs6475526）等位基因頻率分布比較[n（%）]

3 討論

高危型HPV 持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的主要病因。宮頸癌給個(gè)人、家庭帶來(lái)極大影響，而宮頸疾病的過(guò)度治療也給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，且這種情況有明顯的上升趨勢(shì)[4]。為加強(qiáng)宮頸高危型HPV 相關(guān)疾病的防治工作，國(guó)家對(duì)于“兩癌”的篩查就包括宮頸癌[5]，這將對(duì)婦女健康生活質(zhì)量的提高、社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展有重要意義。此外，宮頸癌患者臨床特征、平均住院日、快速增長(zhǎng)的手術(shù)費(fèi)及居高不下的藥費(fèi)是造成高額住院費(fèi)用的主要因素[6]。因此，控制HPV 感染的轉(zhuǎn)歸，對(duì)降低宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展為宮頸癌、減少宮頸癌發(fā)病機(jī)會(huì)均有較大社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益[7]。

研究認(rèn)為[8-9]，HPV 雖是誘發(fā)宮頸癌、宮頸上皮內(nèi)瘤變的重要病原體，但僅有少數(shù)的HPV 感染者最終罹患宮頸癌，其余呈HPV 病毒攜帶狀態(tài)，部分發(fā)展成為宮頸上皮內(nèi)瘤變，說(shuō)明HPV 感染后自然結(jié)局在個(gè)體之間存在著非常大的差異。TNF-β是一種細(xì)胞毒性蛋白，主要由活化的T 細(xì)胞產(chǎn)生，是細(xì)胞免疫的重要因子，同時(shí)在先天免疫調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮重要作用，能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)和破壞癌細(xì)胞[10]。TNF-β 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也受基因多態(tài)性的影響，有研究表明rs909253 和rs2239704 組成的SNPs單倍體可增加非何杰金淋巴瘤發(fā)生危險(xiǎn)。IFN-α屬于Ⅰ型干擾素，是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的一類細(xì)胞因子，主要參與先天免疫反應(yīng)和抗病毒感染， HPV 感染亦與IFN-α 的表達(dá)相關(guān)。有報(bào)道rs6475526 基因多態(tài)性與結(jié)直腸癌的預(yù)后相關(guān)[11]，可以作為獨(dú)立的生物標(biāo)記物評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)，國(guó)外學(xué)者報(bào)道認(rèn)為[12]，在印度女性中TNF-β 基因rs909253 位點(diǎn)多態(tài)性與宮頸癌的不良預(yù)后相關(guān)，并可能是由于CC 基因型關(guān)聯(lián)的TNF-β 基因低表達(dá)所導(dǎo)致。與此相對(duì)的是在南非女性的研究中rs909253 位點(diǎn)多態(tài)性與宮頸癌并無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。其它研究表明仍需要進(jìn)行更大樣本量的前瞻性研究或相匹配的病例對(duì)照研究來(lái)進(jìn)一步明確是否IFN-a 基因rs6475526 位點(diǎn)多態(tài)性與宮頸HPV 感染風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，減少偏倚，并進(jìn)一步明確IFN-a 基因rs6475526 位點(diǎn)多態(tài)性是否與單一亞型的HPV 感染風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[13]。通過(guò)收集高危型HPV陽(yáng)性病例，根據(jù)病理確診CIN 級(jí)別分為不同組別，與體檢HPV 和病理細(xì)胞學(xué)雙陰人員樣本進(jìn)行對(duì)照，運(yùn)用PCR 擴(kuò)增和Sanger 測(cè)序法檢測(cè)各組基因多態(tài)性，結(jié)果顯示：各組別與對(duì)照組比較，rs909253、rs2239704、rs6475526 基因型分布頻率和等位基因分布頻率存在明顯差異。CC 基因型攜帶者的HPV感染的累積陰性率最低，且該型攜帶者的預(yù)后更差，復(fù)發(fā)率更高，更容易在高級(jí)宮頸疾病組出現(xiàn)。因此，推斷TNF-β、IFN-α 基因在HPV 相關(guān)子宮頸癌及宮頸病變發(fā)生及進(jìn)展中可能起到一定的作用。TNF-β 基因rs909253、rs2239704 等位基因可能通過(guò)影響宮頸局部的免疫狀態(tài)進(jìn)而影響了HPV 感染后的轉(zhuǎn)歸，導(dǎo)致HPV 感染持續(xù)化，細(xì)胞和組織進(jìn)一步向?qū)m頸內(nèi)瘤樣變發(fā)展，增加了宮頸癌的危險(xiǎn)性。且CC基因型攜帶者更傾向于HPV 感染的持續(xù)和復(fù)發(fā)[14-15]。持續(xù)追蹤研究病例，記錄宮頸疾病的進(jìn)行性變化和后續(xù)結(jié)局，將對(duì)本研究有非常有益的補(bǔ)充作用。

綜上所述，可將TNF-β、IFN-α 基因多態(tài)性作為宮頸病變分子分型指標(biāo)，尤其是建立TNF-β 的候 選SNP rs909253、rs2239704 和IFN-α 的 候 選SNP rs6475526 的PCR 基因擴(kuò)增+Sanger（第一代）測(cè)序檢測(cè)方法，能夠準(zhǔn)確識(shí)別并判讀SNP 的類型，從而有目的控制HPV 感染的轉(zhuǎn)歸，降低宮頸上皮內(nèi)瘤變進(jìn)展，為腫瘤的精準(zhǔn)預(yù)防與控制提供依據(jù)。