張孟麗，張衛(wèi)明，束成杰*

(1. 南京師范大學生命科學學院，江蘇 南京 210023；2. 南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211100)

戈寶麻(ApocynumvenetumL.)屬夾竹桃科植物，根據古藥典記載，其主要成分是黃酮類化合物，具有消炎止咳、強心利尿、降血壓、降血脂、增強免疫、抗衰老的作用[1]。蘆丁作為黃酮類化合物中的一類，具有清除自由基、促進成骨細胞的生長、降低血糖、抑制結腸癌和前列腺癌等作用[2-6]。因此本研究通過響應面法優(yōu)化葉中蘆丁提取工藝，為今后戈寶麻葉片藥材評價提供進一步的參考。

響應面法(Response surface methodology)可以通過二次擬合出多個因素與響應值的函數關系，使之得出一個回歸方程來探求最優(yōu)的提取條件，是一種優(yōu)化得出最合理條件的統(tǒng)計方法[7-8]。該方法大量用于優(yōu)化植物黃酮類物質及多糖含量方面的研究，例如：Li等通過響應面及高效液相層析對槐花中蘆丁含量進行優(yōu)化[9]，Erkan等通過響應面方法優(yōu)化葡萄提取物的抗氧化活性[10]。中心組合設計實驗Box-Benhnken可進行3～7個因素范圍內的實驗，在因素相同時比中心復合設計所需試驗次數少，可以評估因素的非線性影響，適用于所有因素均為計量值的試驗，使用時無需多次重復[11]。

本研究依據響應面法中心組合設計試驗Box-Benhnken，根據單因素試驗結果對乙醇回流提取蘆丁工藝進行優(yōu)化，確定最優(yōu)提取工藝，對戈寶麻的藥理學應用提供進一步的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戈寶麻(產地新疆阿勒泰)由南京野生植物綜合利用研究院提供；NH-4數顯恒溫水浴鍋(金壇市三壇儀器廠)；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器責任有限公司)；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；KF-1209電子天平(凱豐集團有限公司)；BCD-183A冰箱(合肥榮事達電冰箱有限公司)；液相色譜儀1200系列(美國Agilent公司)；微孔濾膜(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 試劑

蘆丁標準品(純度≥98%)(上海源葉生物科技有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純(美國Fisher Scientific公司)；磷酸、乙醇為分析純(南京化學試劑有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁提取及測定

本試驗用乙醇作為提取劑，采用回流提取法提取蘆丁。將戈寶麻葉除雜干燥，粉碎，稱取粉末50 g，乙醇回流提取，合并提取液，離心后過濾，放至室溫，減壓回收溶劑，收集濾液，微膜過濾，得樣品液。

(1)色譜條件：流動相：乙腈：0.25%磷酸，流速1.0 mL/min，檢測波長為360 nm[12]。

(2)標準曲線：準確稱取蘆丁對照品10.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得蘆丁母液，置4℃冰箱避光保存?zhèn)溆肹13]；將母液稀釋成20、40、60、80、100 μg/mL，分別精密吸取20 μL進樣，得線性關系良好的回歸方程。

(3) 樣品測定：精密吸取上述樣品液20 μL進樣，用標準曲線計算其蘆丁含量。

1.3.2 單因素試驗

(1)乙醇濃度 精密稱取戈寶麻葉粉末50 g，共5份，分別加入8倍的體積分數為50%、60%、70%、80%、90%乙醇，在80℃下回流提取3次，每次1 h，按 1.3.1項下方法制備供試品溶液，按1.3.1項下色譜條件測定蘆丁得率。

(2)提取溫度 精密稱取戈寶麻葉粉末50 g，共5份，加入8倍的體積分數為70%的乙醇，分別在50、60、70、80、90℃下回流提取3次，每次1 h，按1.3.1項下方法制備供試品溶液，按1.3.1項下色譜條件測定蘆丁得率。

(3)提取時間 精密稱取戈寶麻葉粉末50 g，共4份，加入15倍的體積分數為70%乙醇在80℃條件下回流提取3次，分別提取1、2、3 h，按 1.3.1項下方法制備供試品溶液，按1.3.1項下色譜條件測定蘆丁得率。

(4)提取次數 精密稱取戈寶麻葉粉末50 g，共4份，加入15倍的體積分數為70%乙醇，在80℃條件下回流提取1 h，分別提取1、2、3次，按 1.3.1項下方法制備供試品溶液，按1.3.1項下色譜條件測定蘆丁得率。

(5)物料比 精密稱取戈寶麻葉粉末50 g，共3份，加入6、8、10、12、15倍的體積分數為70%乙醇，在80℃條件下回流提取3次，每次1 h，按 1.3.1項下方法制備供試品溶液，按1.3.1項下色譜條件測定蘆丁得率。

1.4 響應面法優(yōu)化試驗設計

通過響應面法，依據Box-Benhnken-Design方法原理，聯(lián)系單因素的試驗結果，以蘆丁得率為響應值(Y)，建立回歸曲線方程。采用 Design-Expert 10 軟件來對數據進行處理與回歸分析，選出最佳提取工藝。響應面試驗因素水平表見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.5 數據處理

所有數據均為平均值±平均標準誤差(S.E.M)。數據分析使用SPSS 12.0軟件完成(SPSS Inc., Chicage, USA)。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

高效液相層析已經廣泛應用于天然植物有效成分的定量和定向分析。如圖1所示，為蘆丁標準品和戈寶麻葉樣品溶液高校液相色譜圖；如圖2為蘆丁標準曲線，計算得知，蘆丁的峰面積與質量濃度呈線性關系，回歸方程為y=27.011x-10.74，r=0.9936(y為峰面積，x為質量濃度，r為相關因數)；結果表明，當蘆丁進樣濃度在0.01～0.1 mg/mL的范圍時，線性關系良好。

圖1 蘆丁標準品及樣品溶液高效液相色譜圖

圖2 蘆丁標準曲線

2.2 精密度試驗

取某一供試品溶液，精密吸取20 μL，按“1.3.1”色譜條件分別連續(xù)進樣6次，測定供試品溶液中蘆丁的峰面積，計算金絲桃苷及蘆丁含量的RSD值，以評價儀器的精密度[14-20]。測得葉中蘆丁含量的RSD值為2.8%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

取某一供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件，分別在0、2、4、6、8、10 h進樣20μL，測定供試品溶液中蘆丁的峰面積，計算蘆丁含量的RSD值，以評價供試品溶液的穩(wěn)定性[14-20]。葉中蘆丁含量的RSD值為2.5% (n=6)，表明各供試品溶液在配制24 h內穩(wěn)定。

2.4 重復性試驗

如表8，取某一供試品溶液3份，并進行HPLC測定，記錄峰面積計算蘆丁含量的RSD值，以評價方法的重現性[14-20]。葉中蘆丁含量的RSD值分別為2.3% (n=3)，表明該方法的重復性滿足要求。

2.5 回收率試驗

如表2，取戈寶麻葉樣品液1 mL，加入對照品，制備供試品溶液，并在相同色譜條件下進樣20 μL，測定峰面積，計算平均加樣回收率及RSD值[14-20]。測得葉中蘆丁平均加樣回收率為 96.9%；RSD為 2.6% (n=6)；

表2 葉中蘆丁加樣回收試驗結果

2.6 單因素試驗結果

2.6.1 乙醇濃度對蘆丁提取率的影響

如圖3，在乙醇濃度為50%之前，隨乙醇濃度增加，蘆丁提取率不斷增加，在50%時提取率達到一個峰值，濃度為50%～60%時，蘆丁提取率緩慢下降，之后60%～80% 時蘆丁提取率又升高，濃度為80%時提取率又達到另一峰值，80%后提取率又下降，而乙醇濃度為80%時蘆丁提取率最高，因此選擇乙醇濃度為80%。

圖3 乙醇濃度對蘆丁得率的影響

2.6.2 提取溫度對蘆丁提取率的影響

如圖4，在70℃之前，隨溫度升高，蘆丁提取率不斷增加，在70℃時提取率達到最大峰值，從70℃到90℃提取率緩慢下降后稍有回升，原因可能是溫度過低時蘆丁不能得到充分提取，溫度過高則可能導致蘆丁降解。因此選擇提取溫度為70℃。

圖4 提取溫度對蘆丁得率的影響

2.6.3 提取時間對蘆丁提取率的影響

如圖5，隨著提取時間增加，戈寶麻葉中蘆丁提取率呈現先增加后降低的趨勢，在 2 h 時最大。因此，確定最優(yōu)的提取時間為2 h。

2.6.4 提取次數對蘆丁提取率的影響

如圖6，隨著提取次數增加，戈寶麻葉中蘆丁提取率呈現先增加后降低的趨勢，在提取2次時得率最高，原因可能是提取2次時蘆丁已得到充分提取，在提取第3次時蘆丁成分部分分解導致得率下降。因此，確定最優(yōu)的提取次數為2次。

圖5 提取時間對蘆丁得率的影響

圖6 提取次數對蘆丁得率的影響

2.6.5 物料比對蘆丁提取率的影響

如圖7，在物料比在1∶4～1∶10之間時，可能是因為蘆丁未能充分溶解于乙醇中，導致提取含量變化不大；隨著乙醇量增加，溶解在乙醇里的多糖也隨之增加，因此物料比在1∶10～1∶15時，蘆丁提取率也在增加，但在1∶12時，多糖得率達到最大峰值，從而確定最優(yōu)物料比為1∶12。

2.7 響應面實驗結果及分析

2.7.1 響應面法設計及結果

以戈寶麻蘆丁得率為響應值Y，以提取時間A，提取溫度B，提取次數C，物料比D，乙醇濃度D 為自變量進行響應面法分析試驗，試驗方案和結果見表3。

2.7.2 多元二次響應面回歸模型的建立和方差分析

響應面法比傳統(tǒng)的單參數方法更加優(yōu)化，而且節(jié)省時間和材料。表3結果利用響應面法進行多元回歸擬合分析，軟件得出一個回歸方程為：R=+0.56-0.005179A+0.024B+0.10C+0.030D-0.041E+0.034AB+0.036AC×0.016AD-0.023AE-0.074BC-0.0592BD-0.00938BE-0.012CD+0.036CE+0.006572DE-0.062A2+0.007711B2-0.044C2-0.013D2-0.035E2，決定系數是R2=0.9488。

圖7 物料比對蘆丁得率的影響

模型的“Pr > F” = 0.0013 < 0.01，所以該模型是高度顯著的。失擬項“Pr > F” < 0.0001，說明選取這個模型是合理的，可以通過此模型來預測戈寶麻蘆丁最優(yōu)提取條件，見表4?；貧w方程中 C、A2對戈寶麻蘆丁得率影響高度顯著，E、BC對多糖得率影響是顯著，說明溫度、時間、次數、乙醇濃度對蘆丁得率影響明顯，并且各因素之間有相互作用的關系，同時說明各因素條件之間對于響應值的影響并不是簡單的線性關系。研究方程的變量系數值可看出，各個影響因素對多糖得率影響大小的關系是提取次數 > 乙醇濃度 > 物料比 > 提取溫度 > 提取時間。

表3 Box-Behnken-Design 試驗設計及結果

續(xù)表3 Box-Behnken-Design 試驗設計及結果

表4 試驗結果方差分析表

2.8 響應面法分析因素間的相互作用

根據回歸方程，固定其它3個因素在零水平上，研究另外2個因素間的交互效應，作響應曲面圖，分析各影響因素對多糖提取率的影響以及各因素間的交互效應；響應面影響因素提取時間(A)和提取次數(C) 、提取次數(C) 和乙醇濃度(E) 、物料比(D) 和乙醇濃度(E) 、提取時間(A)和乙醇濃度(E)、提取時間(A)和物料比(D)、提取時間A和提取溫度B、提取次數C和提取溫度(B)、提取溫度(B)和乙醇濃度(E)、提取溫度(B)和物料比(D)、提取次數(C)和物料比(D)的交互作用的響應面和等高線分別如圖8～17 所示。響應面坡度相對平緩表示兩因素交互作用不顯著，坡度相對較陡表示兩因素交互作用顯著; 等高線的形狀可反映出交互效應的強弱大小，等高線越密集，說明二者交互作用越顯著，等高線越疏則相反，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則相反[11]。

圖8 提取次數和提取時間對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

圖9 提取次數和乙醇濃度對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

如圖8-17，3-D響應面和等高線圖顯示出在固定3個因素零水平條件下其它兩個因素對羅布麻葉片蘆丁得率的影響。其中提取溫度和提取次數交互作用對多糖得率影響比較顯著，其它每兩個因素交互作用不顯著，表現為曲面較為平緩。如圖8，蘆丁得率隨提取次數增加而逐漸增大，隨提取時間增加蘆丁含量先上升后下降，蘆丁得率的變化隨著提取時間的變化大于提取次數的變化，說明在提取時間和提取次數兩個因素中受提取時間的影響較大。如圖9，蘆丁得率的變化隨著乙醇濃度的變化未發(fā)生明顯變化，蘆丁得率隨提取次數增加而逐漸增大，其中提取次數對蘆丁得率影響較大。如圖10，乙醇濃度和物料比變化對蘆丁得率都影響不顯著，但是乙醇濃度對蘆丁得率影響比物料比顯著。如圖11，乙醇濃度變化對蘆丁得率影響不顯著，隨提取時間增加蘆丁含量先上升后下降，其中提取時間對蘆丁得率影響大于乙醇濃度對蘆丁得率影響。如圖12，表現蘆丁得率隨提取時間增加蘆丁含量先上升后下降，物料比對蘆丁得率沒有顯著影響。如圖13，提取溫度對蘆丁得率沒有顯著影響，其中提取時間對蘆丁得率影響大于提取溫度對蘆丁得率影響。如圖14，提取溫度和提取次數交互作用對蘆丁得率影響比較顯著，蘆丁得率隨提取次數和提取溫度的同時增加而逐漸增大，其中提取次數對蘆丁得率的影響大于提取溫度。如圖15，乙醇濃度和提取溫度的交互作用不顯著，乙醇濃度對蘆丁得率影響較大。如圖16，提取溫度和物料比對蘆丁得率沒有顯著作用。如圖17，提取次數對蘆丁得率影響比物料比更顯著。綜合3-D響應面和等高線圖得出，提取時間、提取次數、物料比對蘆丁得率影響具有顯著性。

圖10 物料比和乙醇濃度對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

圖11 提取時間和乙醇濃度對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

圖12 提取時間和物料比對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

圖13 提取時間和提取溫度對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

圖14 提取次數和提取溫度對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

圖15 提取溫度和乙醇濃度對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

圖16 提取溫度和物料比對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

圖17 提取次數和物料比對蘆丁得率交互作用影響的響應面和等高線圖

2.9 驗證試驗

根據響應面法軟件進行參數的最優(yōu)化分析，得出提取率的優(yōu)化條件為提取溫度 72.21℃、提取時間2.080 h、料液比1∶14.866 (g ∶mL)、提取3次、提取溫度60℃、乙醇濃度86.189%。在此工藝條件下，戈寶麻中蘆丁理論得率為0.685%。為了驗證該法的可靠性以及可行性，用最佳條件進行試驗。

考慮到實際操作的可行性與簡便性，將蘆丁的提取條件修正為提取溫度60℃、提取時間2h、料液比1∶15 (g ∶mL)、提取3次、乙醇濃度86%，結果得出戈寶麻中蘆丁得率的實際值為 0.677%，與理論值非常接近；通過響應面法設計試驗，蘆丁提取率得到很大提高。因此，利用響應面分析法得到的戈寶麻提取條件真實可靠，具有實用價值。

3 討論

目前正交實驗被廣泛應用于各種藥用成分的提取，但是正交實驗在實際生活應用中存在諸多局限性，響應面試驗設計法是用一個多元二次回歸方程，擬合試驗中多個因子與響應值間的關系，通過計算得極值則能達到優(yōu)化目的[21-22]。

本研究在單因素試驗基礎上，采用響應面法對戈寶麻中蘆丁的提取工藝進行優(yōu)化。結果顯示，戈寶麻葉中蘆丁的最優(yōu)提取條件是提取溫度60℃、提取時間2.080 h、提取3次，料液比1∶14.866 (g:mL)，乙醇濃度80%，理論最佳蘆丁得率為0.685%，實際蘆丁得率為0.677%。本研究說明通過響應面法優(yōu)化葉中蘆丁提取工藝可行性很高，并且具有實際使用的價值，減少了藥用活性成分提取的盲目性，為戈寶麻中抗氧化物質進一步開發(fā)利用提供了理論指導，為新疆阿勒泰地區(qū)戈寶麻資源利用及加工奠定基礎。