李 香，劉 帥，魏海峰1,*，趙雨朦，趙肖依，張明亮，何 潔，夏 寧，霍玉潔，牛禹霽，于 婷，魏文玥

(1.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023；2.大連海洋大學(xué) 海洋科技與環(huán)境學(xué)院，遼寧 大連 116023；3.遼寧省近岸海洋環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023)

近年來(lái)，隨著我國(guó)沿海經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展，大量石油烴類污染物通過(guò)降雨、降塵或地表徑流等方式進(jìn)入河流或海洋。石油烴類在海洋中受到物理、化學(xué)和生物作用分解產(chǎn)生多種多環(huán)芳烴(PAHs)，如菲、三甲基菲、蒽、二甲基蒽和苯并[a]芘等。多環(huán)芳烴不僅具有較強(qiáng)的致癌、致畸和致突變性，還具有免疫毒性，會(huì)擾亂生物體抗氧防御系統(tǒng)的正常功能[1], 對(duì)河口環(huán)境中的生物及人類健康造成嚴(yán)重威脅，進(jìn)而導(dǎo)致河口及濱岸帶生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生衰變和退化[2-3]。翅堿蓬(Suaedasalsa)是中國(guó)北方沿海灘涂的優(yōu)勢(shì)種，屬一年生耐鹽性濕生草本植物。研究表明，翅堿蓬在污染環(huán)境中有較強(qiáng)的抗逆性[4-5]。許崇彥等[6]指出翅堿蓬能使鹽堿土壤中的石油烴質(zhì)量比下降，對(duì)石油烴污染的鹽堿土壤具有一定修復(fù)作用。在不同環(huán)境介質(zhì)下，石油烴對(duì)翅堿蓬生長(zhǎng)的影響已有多篇報(bào)道，如高乃媛等[7]通過(guò)水培試驗(yàn)研究石油烴對(duì)翅堿蓬生理特性和抗氧化酶系統(tǒng)的影響；趙大傳等[8]通過(guò)土培試驗(yàn)研究鹽漬化條件下土壤石油污染對(duì)翅堿蓬生長(zhǎng)的影響；何潔等[9]通過(guò)土培試驗(yàn)研究翅堿蓬栽培對(duì)石油污染土壤理化性質(zhì)的影響。然而在水和土壤兩種環(huán)境介質(zhì)中石油烴污染對(duì)翅堿蓬生長(zhǎng)影響的比較研究較少。陳忠林等[10]指出土壤環(huán)境和水環(huán)境不同會(huì)影響離子液體對(duì)植物的脅迫效果，且水和土壤環(huán)境介質(zhì)不同，在不同環(huán)境介質(zhì)中生長(zhǎng)的同種植物也會(huì)出現(xiàn)離子液體吸收和生理生化等方面的差異。蒽和菲是最具代表性的三環(huán)多環(huán)芳烴，在石油中含量較高，關(guān)于其毒性的研究報(bào)道較多[11-12]。3-甲基菲和2-甲基蒽是菲和蒽的烷基化衍生物，國(guó)內(nèi)外關(guān)于這種衍生物毒性的報(bào)道較少，這可能導(dǎo)致由多環(huán)芳烴衍生物造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)被低估。因此，本文采用水培和土培兩種試驗(yàn)方法，通過(guò)研究不同濃度蒽和3-甲基菲兩種多環(huán)芳烴對(duì)翅堿種子萌發(fā)的影響，以期為海洋石油烴類對(duì)翅堿蓬的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

翅堿蓬種子采自盤錦紅海灘景區(qū)，風(fēng)干后在實(shí)驗(yàn)室保存；土壤取自遼寧省盤錦市紅海灘濕地風(fēng)景區(qū)；水為實(shí)驗(yàn)室純水，蒽和3-甲基菲均購(gòu)自Sigema公司，純度大于96%。

1.2 試驗(yàn)方法

水培試驗(yàn)：挑選大小一致、形態(tài)飽滿的翅堿蓬種子，播種于直徑為12.5 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻播種經(jīng)過(guò)用0.25%的高錳酸鉀溶液浸種30分鐘并進(jìn)行消毒后的翅堿蓬種子20顆，分別加入不同濃度(1、50、100、500和1000 μg/L)蒽和3-甲基菲溶液各15 mL，蓋上封口膜防止水分流失，另外設(shè)置純水對(duì)照組和助溶劑丙酮對(duì)照組，每處理3組平行。

土培試驗(yàn)：于直徑為12.5 cm的玻璃培養(yǎng)皿中加入經(jīng)過(guò)200目篩分后的土壤30 g，均勻平鋪于培養(yǎng)皿底部，分別加入不同濃度(1、50、100、500和1000 μg/L)蒽和3-甲基菲溶液各12 mL，挑選大小一致、形態(tài)飽滿的翅堿蓬種子，均勻播種于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿播種翅堿蓬種子20顆，于翅堿蓬種子表層覆蓋厚度約為0.1～0.2 mm的土壤，蓋上封口膜防止水分流失，同時(shí)設(shè)置純水和丙酮對(duì)照組，每處理3組平行。

種子萌發(fā)過(guò)程中采用避光處理，水培及土培幼苗實(shí)驗(yàn)均在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，光源為L(zhǎng)ED白光，光照強(qiáng)度為(6200±200) lx，光暗比為12∶12，溫度控制在(20±1)℃。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)芽率測(cè)定

每天記錄發(fā)芽數(shù)量。以黑色種子皮破裂為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算發(fā)芽率。發(fā)芽率=(供試種子的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.3.2 半數(shù)抑制濃度(IC50)計(jì)算

建立種子發(fā)芽率與對(duì)應(yīng)的多環(huán)芳烴污染物濃度的線性回歸方程。當(dāng)種子發(fā)芽率為50%時(shí)，對(duì)應(yīng)的多環(huán)芳烴污染物濃度即為該種多環(huán)芳烴對(duì)翅堿蓬種子發(fā)芽率的IC50值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)初步整理及圖表繪制，應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行各處理翅堿蓬種子發(fā)芽率的多重比較。顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒽對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響

2.1.1 水培條件下蒽對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響

水培條件下蒽對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響結(jié)果如圖1所示。隨著時(shí)間推移，各處理組的翅堿蓬發(fā)芽率逐漸升高。第2～7天，1～100 μg/L蒽處理組發(fā)芽率與純水對(duì)照組和丙酮對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)，說(shuō)明1～100 μg/L的蒽對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率沒(méi)有影響。當(dāng)蒽濃度為500～1000 μg/L時(shí)，隨著濃度增大，翅堿蓬發(fā)芽率降低，蒽對(duì)翅堿蓬種子發(fā)芽的抑制作用增加，說(shuō)明蒽對(duì)翅堿蓬的發(fā)芽影響的閾值為500 μg/L。當(dāng)蒽濃度為1000 μg/L時(shí)翅堿蓬發(fā)芽率最低，且與水和丙酮對(duì)照組均出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)。

圖1 水培條件下不同蒽濃度翅堿蓬的發(fā)芽率

2.1.2 土培條件下蒽對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響

土培條件下蒽對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響結(jié)果如圖2所示。隨著時(shí)間推移，各處理組翅堿蓬發(fā)芽率逐漸升高。第1～3天，1 μg/L蒽處理組發(fā)芽率與純水對(duì)照組和丙酮對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)，說(shuō)明1 μg/L蒽在短時(shí)間內(nèi)對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率沒(méi)有影響。第6～7天，隨著蒽濃度增大，翅堿蓬發(fā)芽率逐漸降低，受抑制作用逐漸增大，且在濃度為1～50 μg/L之間的抑制作用較小，50 μg/L之后抑制作用增大，說(shuō)明蒽對(duì)翅堿蓬的發(fā)芽影響的閾值為50 μg/L。在蒽濃度為1000 μg/L時(shí)翅堿蓬發(fā)芽率最低，且與純水和丙酮對(duì)照組均出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)。

圖2 土培條件下不同蒽濃度翅堿蓬的發(fā)芽率

2.1.3 水培與土培第7天蒽對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響比較

以第7天發(fā)芽率為例，如圖3所示。水培條件下，1 μg/L蒽處理組，翅堿蓬發(fā)芽率為63.33%，與純水和丙酮對(duì)照組相比降低1.67%。蒽大于1 μg/L處理組的翅堿蓬發(fā)芽率隨著蒽濃度增大而降低。 7天后，1000 μg/L處理組的發(fā)芽率僅為16.95%。土培條件下，1 μg/L蒽處理組，翅堿蓬發(fā)芽率為53.33%，與純水和丙酮對(duì)照組相比降低5%。說(shuō)明蒽在低濃度時(shí)土培條件對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響大于水培條件。蒽大于1 μg/L處理組的翅堿蓬發(fā)芽率隨著蒽濃度增大而降低，二者之間存在顯著劑量-效應(yīng)關(guān)系。7天后，1000 μg/L處理組翅堿蓬發(fā)芽率為33.33%。相關(guān)分析表明，蒽在水培條件下對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的IC50值為3.68 μg/L，R2為0.69，土培條件下對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的IC50值為2.88 μg/L，R2為0.91。說(shuō)明土培條件下翅堿蓬種子發(fā)芽率的IC50值低于水培條件，且土培條件下可靠性更高。

圖3 水培與土培條件下第7天不同蒽濃度翅堿蓬的發(fā)芽率

2.2 3-甲基菲對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響

2.2.1 水培條件下3-甲基菲對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響

水培條件下3-甲基菲對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響結(jié)果如圖4所示。隨著時(shí)間推移，各處理組的翅堿蓬發(fā)芽率逐漸升高。隨著3-甲基菲濃度增大，翅堿蓬發(fā)芽率逐漸降低，受抑制作用逐漸增大，且在1 μg/L時(shí)抑制作用較小，與純水和丙酮對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。第3～7天, 50 μg/L之后抑制作用逐漸增大，在3-甲基菲濃度為1000 μg/L時(shí)發(fā)芽率最低，且與純水和丙酮對(duì)照組均出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)。

圖4 水培條件下不同3-甲基菲濃度翅堿蓬的發(fā)芽率

2.2.2 土培條件下3-甲基菲對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響

土培條件下3-甲基菲對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響結(jié)果如圖5所示。隨著時(shí)間推移，各處理組翅堿蓬發(fā)芽率逐漸升高。隨著3-甲基菲濃度增大，翅堿蓬發(fā)芽率逐漸降低，受抑制作用逐漸增大。在1 μg/L時(shí)抑制作用較小，與純水和丙酮對(duì)照組均無(wú)顯著性差異(p>0.05)。第4～7天, 50 μg/L之后抑制作用逐漸增大，在3-甲基菲濃度為1000 μg/L時(shí)發(fā)芽率最低，且與純水和丙酮對(duì)照組均出現(xiàn)顯著性差異(p<0.05)。

2.2.3 水培與土培第7天3-甲基菲對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響比較

以第7天發(fā)芽率為例，如圖6所示。水培條件下，1 μg/L 3-甲基菲處理組，翅堿蓬發(fā)芽率為70%，與純水和丙酮對(duì)照組相比降低8%。3-甲基菲大于1 μg/L的處理組，翅堿蓬發(fā)芽率隨著3-甲基菲濃度增大而降低，二者之間存在顯著劑量-效應(yīng)關(guān)系。7天后，1000 μg/L處理組的發(fā)芽率僅為45%。土培條件下，1 μg/L 3-甲基菲處理組，翅堿蓬發(fā)芽率為51.67%，與純水和丙酮對(duì)照組相比降低6.66%。說(shuō)明3-甲基菲在低濃度時(shí)水培條件對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響大于土培條件。3-甲基菲大于1 μg/L的處理組，翅堿蓬發(fā)芽率隨著3-甲基菲濃度增大而降低，二者之間存在顯著劑量-效應(yīng)關(guān)系。在土培條件下，1000 μg/L 3-甲基菲處理組比1～500 μg/L 3-甲基菲處理組翅堿蓬發(fā)芽率顯著降低。7天后，1000 μg/L處理組的發(fā)芽率僅為8.57%。相關(guān)分析表明，3-甲基菲在水培條件下對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的IC50值為4.85 μg/L，R2為0.97，土培條件下對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的IC50值為2.30 μg/L，R2為0.88。說(shuō)明土培條件下翅堿蓬發(fā)芽率的IC50值低于水培條件，且水培條件下可靠性更高。

圖5 土培條件下不同3-甲基菲濃度翅堿蓬的發(fā)芽率

圖6 水培與土培條件下第7天不同3-甲基菲濃度翅堿蓬的發(fā)芽率

3 討論

3.1 不同濃度多環(huán)芳烴對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響

在水培和土培試驗(yàn)中，蒽和3-甲基菲對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率均表現(xiàn)出顯著抑制作用，但臨界值濃度范圍存在差異。蒽在低濃度時(shí)(≤500 μg/L)對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率抑制作用不顯著，當(dāng)濃度為1000 μg/L時(shí)，表現(xiàn)出顯著抑制作用。這可能是因?yàn)橥ǔＶ参飳?duì)于多環(huán)芳烴污染具有一定的耐受閾值，在閾值范圍內(nèi)，植物生長(zhǎng)受到的影響較小，甚至表現(xiàn)為刺激生長(zhǎng)，而超過(guò)此閾值，植物正常生長(zhǎng)就會(huì)受到抑制[13]。Maliszewska和Smreczak[14]用蒽和芘分別對(duì)土培燕麥和玉米等6種作物進(jìn)行脅迫試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)初期土壤中的PAHs質(zhì)量濃度低于10 mg/L時(shí)，對(duì)作物生長(zhǎng)有刺激作用，最低的植物毒害閾值可達(dá)100 mg/L。洪有為和袁東星[15]研究發(fā)現(xiàn)隨著菲濃度升高，秋茄(Kandeliacandel)幼苗根系和地上部分的生長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，低濃度處理刺激了植株根系和地上部分生長(zhǎng)量的增加，高濃度處理不利于植株生長(zhǎng)。在PAHs脅迫下，植物發(fā)芽、株高、根長(zhǎng)、根表面積和葉面積等生長(zhǎng)指標(biāo)均受到抑制[16]。

3.2 不同環(huán)境介質(zhì)對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，土培和水培試驗(yàn)中多環(huán)芳烴類污染物對(duì)翅堿蓬的生長(zhǎng)發(fā)育狀況影響不同。劉萍等[17]報(bào)道，離子液體脅迫會(huì)使植物的發(fā)芽率降低，影響植物的生長(zhǎng)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同。但其研究結(jié)果還表明，離子液體各濃度處理均造成植物發(fā)芽率降低。在本試驗(yàn)中，水培條件下蒽和3-甲基菲低濃度(c≤50 μg/L)處理對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率影響較小，原因是離子液體種類和濃度梯度不同，對(duì)植物的毒害影響也不同[18]。在蒽和3-甲基菲脅迫下，與水培試驗(yàn)相比，土培試驗(yàn)中翅堿蓬發(fā)芽率的增長(zhǎng)速度明顯變低。這可能是因?yàn)橥寥谰哂幸欢ǖ慕Y(jié)構(gòu)性，且其中運(yùn)移的污染物等溶質(zhì)一般具有化學(xué)反應(yīng)特征，勢(shì)必造成結(jié)構(gòu)土壤中化學(xué)反應(yīng)性溶質(zhì)運(yùn)移行為十分復(fù)雜。研究表明，土壤對(duì)石油類污染物的吸附截留及遷移轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)弱與土壤粒徑大小、pH、環(huán)境溫度、有機(jī)質(zhì)含量等因素有關(guān)[19]。

蒽濃度為1000 μg/L脅迫7d后，水培條件下抑制率高于土培；3-甲基菲濃度為1000 μg/L脅迫7d后，水培條件下抑制率低于土培。水培條件下提供的營(yíng)養(yǎng)液是由水和營(yíng)養(yǎng)元素構(gòu)成的，營(yíng)養(yǎng)成分大都以水溶性離子態(tài)存在，水溶性離子態(tài)養(yǎng)分是植物根系吸收養(yǎng)分的主要形態(tài)，礦物質(zhì)養(yǎng)分和氮素幾乎都是以離子形態(tài)被吸收。而在土培條件下直接被吸收的有效離子態(tài)養(yǎng)分不多，大多有機(jī)物都需經(jīng)過(guò)微生物分解，轉(zhuǎn)變成離子態(tài)養(yǎng)分后，才能大量被植物吸收利用[20]。蒽不溶于水，而3-甲基菲溶于水，水培條件下各處理組溶液是由水和不同濃度的多環(huán)芳烴構(gòu)成的，不同濃度蒽處理組溶液中蒽可直接作用于翅堿蓬種子，導(dǎo)致水培條件下抑制率高于土培。

4 結(jié)論

兩種培養(yǎng)方式下，蒽和3-甲基菲兩種多環(huán)芳烴類污染物在低濃度時(shí)對(duì)翅堿蓬種子萌發(fā)無(wú)顯著影響，在高濃度時(shí)對(duì)翅堿蓬種子萌發(fā)產(chǎn)生顯著的抑制作用(P<0.05)，且抑制作用具有典型的劑量-效應(yīng)關(guān)系。不同種多環(huán)芳烴類污染物在不同環(huán)境介質(zhì)中對(duì)翅堿蓬種子萌發(fā)的抑制作用影響不同，水培條件下蒽在高濃度脅迫7 d后對(duì)翅堿蓬發(fā)芽率的影響比土培條件顯著，而3-甲基菲在高濃度脅迫7 d后土培條件下翅堿蓬發(fā)芽率的影響比水培條件顯著。