張桂珍，張 乙，張?jiān)妳R，李 丹，楊 方，徐 洪

（華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山 063000）

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，二氧化硅（SiO2） 能夠在體外激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)，從而促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞的凋亡[1]，并誘導(dǎo)肺泡II 型上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，即上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）[2]。目前多認(rèn)為，EMT 可以導(dǎo)致肺泡II 型上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，能夠引起促炎信號(hào)、膠原合成信號(hào)的活化與釋放，參與肺纖維化進(jìn)程[3]。最近研究顯示，刺猬信號(hào)（hedgehog，HH） 信號(hào)與矽肺纖維化進(jìn)程關(guān)系密切，課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)N-乙?；?絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸（N-acetyl seryl aspartyl lysyl proline，Ac-SDKP） 能夠通過對(duì)腎素血管緊張素系統(tǒng)和HH 信號(hào)的調(diào)節(jié)，進(jìn)而抑制染塵大鼠肺纖維化病變程度，并能夠在體外抑制血管緊張素II介導(dǎo)的HH 信號(hào)的活化和肌成纖維細(xì)胞分化[4]。因此，擬通過體外SiO2誘導(dǎo)的肺泡II 型上皮MLE-12 細(xì)胞的EMT 模型，并給予Ac-SDKP 預(yù)處理，探討Ac-SDKP 能否通過調(diào)控HH 信號(hào)從而拮抗SiO2介導(dǎo)的肺泡II 型上皮細(xì)胞EMT 進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

小鼠MLE-12 肺泡II 型上皮細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞庫）；達(dá)爾伯克（氏） 改良伊格爾（氏） 培養(yǎng)基（dulbecco modified eagle medium，DMEM）（10099141，美 國GIBCO 公 司）；胎牛血清（BI-SH0019，以色列BI 公司）；SiO2（S5631，美國 sigma 公 司）；Ac-SDKP（H-1164，瑞典Bachem 公司）；GDC-0449（S1082，中國Selleck公司）；GANT61（S8075，中國Selleck 公司）；I 型膠原（ab34710，英國Abcam 公司）；α-SMA（ab32575）；I 型膠原（北京博奧森）；E-鈣粘蛋白（E-cadherin，E-cad，北京博奧森）；音刺猬因子（sonic hedgehog，SHH）、Smoothened（SMO）、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白（glioma-associated oncogene homolog，GLI） 1（A7726，A3274，A14675，武漢愛博泰克生物科技有限公司）；GLI 2、α 微管蛋白（Tublin，Tub） （DF7541，AF7010，美國Affinity 生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MLE-12 細(xì)胞使用含體積分?jǐn)?shù)為10 %胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)，取3～5 代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞密度為70%左右時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，無血清同步化過夜。實(shí)驗(yàn)分組為：（1） ①對(duì)照組：無血清DMEM/F12；②SiO2誘導(dǎo)組：無血清DMEM/F12 條件下給予終濃度50 μg/mL 的SiO2誘導(dǎo)；③Ac-SDKP 組：無血清DMEM/F12 條件下給予終濃度為 10-8mol/L Ac-SDKP[5-8]；④SiO2+Ac-SDKP 組： 無血清DMEM/F12 條件下先給予Ac-SDKP 預(yù)處理1 h 后再給予SiO2共誘導(dǎo)；（2） ①溶劑對(duì)照組：無血清含0.1%DMSO 的DMEM/F12；②SiO2誘導(dǎo)組：無血清含0.1%DMSO 的DMEM/F12 條件下給予終濃度50 μg/mL 的SiO2誘導(dǎo)；③GDC-0449 組：無血清DMEM/F12 條件下給予終濃度為2×10-5mol/L的 GDC-449（含終濃度 為 0.1% DMSO）[7]；SiO2+GDC-0449 組：④無血清DMEM/F12 條件下先給予GDC-0449（含終濃度為0.1%DMSO） 預(yù)處理1 h 后再給予SiO2共誘導(dǎo)；（3） ①溶劑對(duì)照組：無血清含0.1%乙醇的DMEM/F12；②SiO2誘導(dǎo)組：無血清含0.1%乙醇的DMEM/F12 條件下給予終濃度50 μg/mL 的SiO2誘導(dǎo)；③GANT61 組：無血清DMEM/F12 條件下給予5×10-6mol/L 的GANT61（含終濃度為0.1%的乙醇）[7]；④SiO2+GANT61 組：無血清DMEM/F12 條件下先給予GANT61（含終濃度為0.1%的乙醇） 預(yù)處理1 h 后再給予SiO2共誘導(dǎo)。

1.3 免疫印跡

每25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入RIPA 裂解液100 μL，刮取細(xì)胞冰上孵育15 min，12 000×g 離心15 min，收集上清。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度后上樣（20 μg/泳道），常規(guī)電泳及電轉(zhuǎn)。一抗（1：1 000 稀釋） 4℃過夜；二抗（1:5 000） 37℃孵育30 min，ECL 發(fā)光試劑顯色。采用Image-Pro-plus 6.0 圖像處理軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，以目的蛋白光密度值與內(nèi)參蛋白光密度值的比值作為該蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料服從正態(tài)分布用描述，多組間比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，有差異時(shí)兩兩比較方差齊采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊采用Tamhane’s 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫印跡結(jié)果顯示（圖1～2，表1～2），予以SMO 抑制劑GDC-0449 或Gli1 抑制劑GANT61，均能夠有效抑制SiO2介導(dǎo)的E-cadherin 蛋白表達(dá)的下調(diào)，并抑制Col I 和α-SMA 蛋白表達(dá)水平的上調(diào)。

免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示（圖3），與對(duì)照組相比，SiO2誘導(dǎo)組中SMO 及Gli 1 強(qiáng)陽性表達(dá)，給予Ac-SDKP 處理后，陽性表達(dá)減弱。免疫印跡結(jié)果顯示（圖4、表3），與對(duì)照組相比，SiO2誘導(dǎo)組中Col I、α-SMA、SHH、SMO、Gli1 及Gli2 蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin 表達(dá)下調(diào)。與SiO2誘導(dǎo)組相比，Ac-SDKP 預(yù)處理組Col I、α-SMA、SHH、SMO、Gli1 及Gli 2 蛋白表達(dá)下調(diào)，E-cadherin 的表達(dá)上調(diào)，以上結(jié)果經(jīng)方差分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

塵肺（包括矽肺） 病是我國最嚴(yán)重的職業(yè)病，以矽結(jié)節(jié)的形成和彌漫性間質(zhì)肺纖維化作為主要特征。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，EMT 在矽肺發(fā)生、發(fā)展中起到了重要的調(diào)節(jié)作用[2]，部分間質(zhì)纖維化區(qū)域存在肺泡上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，上皮細(xì)胞失去原有的緊密連接，變得易于遷移，并釋放促炎因子從而加速的纖維化進(jìn)程[3，5]。因此，抑制肺泡II 型上皮發(fā)生EMT 可能是潛在的抗肺纖維化治療的策略之一[6]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，50 μg/mL SiO2誘導(dǎo)MLE-12 細(xì)胞24 h 時(shí)E-cadherin 表達(dá)水平顯著降低，而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA，以及HH 信號(hào)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子SMO、SHH、GLI1 和GLI2表達(dá)上調(diào)，表明SiO2誘導(dǎo)MLE-12 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程伴隨著HH 信號(hào)的激活。

表1 GDC-0449 對(duì)SiO2 介導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞EMT 的調(diào)節(jié)作用（）Tab.1 Effect of GDC-0449 on SiO2 induced EMT of MLE-12 cells（）

表1 GDC-0449 對(duì)SiO2 介導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞EMT 的調(diào)節(jié)作用（）Tab.1 Effect of GDC-0449 on SiO2 induced EMT of MLE-12 cells（）

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與SiO2 誘導(dǎo)組比較，#P ＜0.05。

表2 GANT61 對(duì)SiO2 介導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞EMT 的調(diào)節(jié)作用（）Tab.2 Effect of GANT61 on SiO2 induced EMT of MLE-12 cells（）

表2 GANT61 對(duì)SiO2 介導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞EMT 的調(diào)節(jié)作用（）Tab.2 Effect of GANT61 on SiO2 induced EMT of MLE-12 cells（）

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與SiO2 誘導(dǎo)組比較，#P ＜0.05。

表3 Ac-SDKP 對(duì)SiO2 誘導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞Col I、α-SMA、E-cadherin 及HH 信號(hào)分子的影響（）Tab.3 Effect of Ac-SDKP on the expression of Col I,α-SMA,E-cadherin and HH signaling molecules in MLE-12 cells induced by SiO2（）

表3 Ac-SDKP 對(duì)SiO2 誘導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞Col I、α-SMA、E-cadherin 及HH 信號(hào)分子的影響（）Tab.3 Effect of Ac-SDKP on the expression of Col I,α-SMA,E-cadherin and HH signaling molecules in MLE-12 cells induced by SiO2（）

與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與SiO2 誘導(dǎo)組比較，#P ＜0.05。

圖1 GDC-0449 對(duì)SiO2 介導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞EMT 的調(diào)節(jié)作用Fig.1 The effect of GDC-0449 on SiO2 induced EMT of MLE-12 cells

圖2 GANT61 對(duì)SiO2 介導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞EMT 的調(diào)節(jié)作用Fig.2 The effect of GANT61 on SiO2 induced EMT of MLE-12 cells

圖3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)MLE-12 細(xì)胞中SMO 和Gli1 蛋白表達(dá)（×200）Fig.3 Expressions of SMO and Gli1 in MLE-12 cells were detected by immunohistochemistry （×200）

圖4 Ac-SDKP 對(duì)SiO2 誘導(dǎo)的MLE-12 細(xì)胞Col I、α-SMA、E-cadherin 及HH 信號(hào)分子的影響Fig.4 Effect of Ac-SDKP on the expression of Col I,α-SMA,E-cadherin and HH signaling molecules in MLE-12 cells induced by SiO2

近來研究也顯示，HH 信號(hào)在肺再生和維持中起到重要的調(diào)節(jié)作用[7]，對(duì)HH 信號(hào)的阻斷也被發(fā)現(xiàn)具有拮抗肺纖維化形成的作用[8-9]。在本研究中，利用HH 信號(hào)SMO 受體抑制劑GDC-0449 和GLI轉(zhuǎn)錄因子抑制劑GANT61 來觀察對(duì)SiO2誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，發(fā)現(xiàn)阻斷HH 信號(hào)能夠顯著抑制SiO2介導(dǎo)的MLE-12 的EMT 進(jìn)程。有研究表明，GANT61 可以通過靶向性抑制Gli1 的表達(dá)上調(diào)E-cadherin，下調(diào)Vimentin，進(jìn)而調(diào)控肺癌細(xì)胞的EMT 進(jìn)程[10]，在非小細(xì)胞肺癌中，采用針對(duì)Hedgehog 信號(hào)通路SMO 的特異性抑制劑能夠有效地逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞的EMT 現(xiàn)象[11]。落新婦苷被發(fā)現(xiàn)能夠通過對(duì)HH 信號(hào)的調(diào)節(jié)，抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的肺泡II 型上皮細(xì)胞和L929 細(xì)胞的EMT 進(jìn)程，上調(diào)E-cadherin、肺泡表面活性物質(zhì)C 的表達(dá)，同時(shí)抑制α-SMA 和Snail 蛋白的表達(dá)，體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)能夠拮抗博來霉素小鼠的肺間質(zhì)纖維化病變程度[8]。HH 信號(hào)的激活，能夠誘導(dǎo)肺常駐間質(zhì)干細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，從而加速的肺纖維化進(jìn)程[9]。在本研究中，也發(fā)現(xiàn)SiO2能夠激活HH 信號(hào)，從而促進(jìn)了MLE-12 細(xì)胞發(fā)生EMT，結(jié)合課題組前期研究結(jié)果[4]，提示HH 信號(hào)的激活在矽肺纖維化進(jìn)展中可能起到了重要的調(diào)控作用。

課題組多年來，圍繞Ac-SDKP 的抗矽肺纖維化作用進(jìn)行了系列研究[1，2，4]，前期已經(jīng)證明矽肺進(jìn)展伴發(fā)EMT 過程，而Ac-SDKP 能夠保護(hù)肺泡II型上皮細(xì)胞，同時(shí)抑制其向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示，予以Ac-SDKP 預(yù)處理，能夠顯著抑制HH 信號(hào)相關(guān)蛋白的活化，進(jìn)而抑制了EMT 的形成。提示Ac-SDKP 能夠通過對(duì)HH 信號(hào)的調(diào)節(jié)，拮抗SiO2介導(dǎo)的肺泡II 型上皮MLE-12 細(xì)胞的EMT 進(jìn)程。