朱興磊，張 凌

（1） 云南師范大學(xué)學(xué)報(bào)編輯部，云南昆明 650092；2） 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所《應(yīng)用天然產(chǎn)物（英文）》編輯部，云南昆明 650201）

蘆筍（Asparagus officinalis L.） 學(xué)名石刁柏，百合科天門(mén)冬屬植物，其嫩莖是具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的名貴蔬菜。蘆筍主要作為新鮮蔬菜和蘆筍罐頭食用，但其可食用部分—嫩莖僅占整株生物學(xué)產(chǎn)量的60%左右，而近40%的老莖則在加工過(guò)程中被丟棄[1]，不僅浪費(fèi)資源，也增加環(huán)境負(fù)擔(dān)。研究顯示這些廢棄物中含有皂苷、黃酮和多糖等活性物質(zhì)[2-3]，其中的皂苷是蘆筍的主要活性因子，是蘆筍抗癌的主要成分，可誘導(dǎo)急性髓性白血病細(xì)胞（HL-60）[4]、人肝癌細(xì)胞（HepG-2） 和人胃癌細(xì)胞（SGC-7901） 凋亡[5-6]。且廢棄的蘆筍老莖中的皂苷含量雖然比嫩莖少，但也達(dá)到嫩莖含量的60%[2，7]，說(shuō)明其具有開(kāi)發(fā)利用的潛力。Wang 等人[8]的研究表明從蘆筍老莖中分離得到的皂苷能夠抑制乳腺、結(jié)腸和胰腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。此外，筆者的前期研究顯示蘆筍老莖皂苷（saponins from old stems ofAsparagus officinalis L.，SAO） 對(duì)高糖高脂飲食引發(fā)的高脂血癥具有顯著的預(yù)防和治療作用[9-10]，對(duì)糖尿病大鼠也有明顯的降血糖作用[11]，可見(jiàn)SAO 具有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景，但目前對(duì)其的安全性評(píng)價(jià)未見(jiàn)報(bào)道。

實(shí)驗(yàn)研究SAO 對(duì)ICR 小鼠經(jīng)口給藥后的急性毒性，為SAO 的安全性評(píng)價(jià)和深入開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SAO 的制備 蘆筍老莖干材料用70%的乙醇（料液比1:10） 80°C 提取，所得提取液減壓濃縮后用水飽和正丁醇1:1 萃取，萃取液減壓濃縮后真空干燥，所得棕色固體再經(jīng)AB-8 型大孔樹(shù)脂純化后冷凍干燥得到淺棕色粉末，即為SAO 成品。從文獻(xiàn)可知，蘆筍中的皂苷主要是甾體皂苷，其母核皂苷元為菝葜皂苷元[12-13]，因此參照趙芳春等人[14]的方法，以菝葜皂苷元為對(duì)照品，測(cè)得SAO中總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%～59%。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 ICR 小鼠64 只，雌雄各半，清潔級(jí)，體重18～22 g，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，試驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滬） 2013-0016。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～25℃（由空調(diào)控制），12 h 明暗輪換（8:00-20:00），通風(fēng)，動(dòng)物自由攝食和飲水。

1.1.3 藥品和試劑 血清葡萄糖（Glu）、血清總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C） 及甘油三酯（TG） 測(cè)定試劑盒購(gòu)自上?？菩郎锛夹g(shù)研究所；其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司生產(chǎn)，酶聯(lián)免疫測(cè)定儀為美國(guó)BIO-TEX 公司生產(chǎn)，BS210S 型電子天平為德國(guó)Sartorius 公司生產(chǎn)，高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)為上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)生產(chǎn)，冷凍干燥儀為美國(guó)SP Scientific-FTS 公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d 后，將64 只ICR 小鼠隨機(jī)分為4 組，每組16 只，雌雄各半，即正常對(duì)照組和3 個(gè)SAO 給藥組，給藥組劑量分別為500、1 000 mg/kg 和4 000 mg/kg。給藥前小鼠禁食不禁水12 h，按20 mL/kg 的體積一次性灌胃給藥，對(duì)照組灌服等體積蒸餾水，給藥后4 h 恢復(fù)自由飲食和飲水，灌胃后連續(xù)觀(guān)察14 d。

1.2.2 觀(guān)察指標(biāo)（1） 一般狀態(tài)觀(guān)察小鼠的皮毛、呼吸、眼睛、鼻子、分泌物、排泄物以及神經(jīng)系統(tǒng)（行為、反應(yīng)及運(yùn)動(dòng)） 等方面的變化情況，詳細(xì)記錄小鼠毒性反應(yīng)的癥狀、出現(xiàn)和消失的時(shí)間以及死亡情況。給藥后8 h 連續(xù)密切觀(guān)察，以后每天觀(guān)察記錄1 次，連續(xù)觀(guān)察14 d；（2） 攝食量、飲水量和體質(zhì)量每天監(jiān)測(cè)小鼠的攝食量和飲水量，0 d（給藥前）、7 d 和14 d 測(cè)量小鼠體質(zhì)量；（3）血液指標(biāo) 小鼠給藥14 d 時(shí)禁食8 h，采血并分離血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作測(cè)定血清Glu、TC、TG 和HDL-C 水平；（4） 臟器系數(shù)小鼠給藥14 d采血后處死，解剖，取心、肝、脾和腎等臟器，稱(chēng)重，并計(jì)算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)計(jì)算公式為：臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行機(jī)率單位加權(quán)回歸法（Bliss 法） 計(jì)算SAO 對(duì)ICR 小鼠的半數(shù)致死量（LD50）[15]。

2 結(jié)果

2.1 毒性反應(yīng)表現(xiàn)

正常對(duì)照組小鼠精神狀態(tài)良好，被毛光亮，無(wú)異常分泌物，糞便正常，試驗(yàn)期內(nèi)無(wú)死亡；SAO 500 mg/kg 組小鼠無(wú)明顯毒性反應(yīng)，呼吸、行為、反應(yīng)及運(yùn)動(dòng)無(wú)明顯異常，糞便正常，無(wú)異常分泌物，試驗(yàn)期內(nèi)無(wú)死亡。SAO 1 000 mg/kg 組在給藥15 min 后有2 只小鼠出現(xiàn)活動(dòng)減少和俯臥，另有2只小鼠出現(xiàn)輕微抽搐，但均在2 h 后恢復(fù)正常，無(wú)異常分泌物，糞便正常，試驗(yàn)期間無(wú)死亡；SAO 4 000 mg/kg 組小鼠在給藥10 min 后出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)，表現(xiàn)為抽搐，15 min 起有小鼠出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈和竄跳后死亡，共有11 只小鼠死亡，死亡時(shí)間均在給藥后2 h 內(nèi)，死亡的小鼠解剖后未見(jiàn)器官異常，存活的5 只小鼠在剩余的觀(guān)察期內(nèi)，除活動(dòng)較少外沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其他異常的現(xiàn)象。

2.2 SAO 對(duì)小鼠的LD50

根據(jù)小鼠的毒性反應(yīng)情況，在本試驗(yàn)條件下測(cè)得SAO 對(duì)小鼠的最大無(wú)毒性反應(yīng)劑量為500 mg/kg；根據(jù)小鼠的死亡情況，計(jì)算得出SAO 對(duì)ICR 小鼠經(jīng)口給藥的LD50 為3460 mg/kg。

2.3 SAO 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)期間各組小鼠的體質(zhì)量變化情況見(jiàn)表1，與正常對(duì)照組小鼠相比，500 mg/kg 和1 000 mg/kg的SAO 對(duì)小鼠的體質(zhì)量沒(méi)有明顯影響（P＞0.05），但SAO 400 0 mg/kg 組存活的5 只小鼠的體質(zhì)量在給藥后7 d （P＜0.05） 和14 d （P＜0.05） 都明顯高于正常對(duì)照組。

2.4 SAO 對(duì)小鼠攝食量和飲水量的影響

各組小鼠的攝食量和飲水量見(jiàn)表2，與正常對(duì)照組相比，500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的SAO 對(duì)小鼠的攝食量和飲水量均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；SAO 400 0 mg/kg 組存活小鼠的攝食量與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但飲水量顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 蘆筍老莖皂苷對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響［（），g］Tab.1 Effect of SAO on body weight of mice in different groups ［（），g］

表1 蘆筍老莖皂苷對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響［（），g］Tab.1 Effect of SAO on body weight of mice in different groups ［（），g］

與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

2.5 SAO 對(duì)小鼠主要臟器系數(shù)的影響

SAO 對(duì)小鼠主要臟器系數(shù)的影響見(jiàn)表3，與正常對(duì)照組小鼠相比，500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的SAO 對(duì)小鼠心、肝、脾和腎的臟器系數(shù)均無(wú)明顯影響（P＞0.05）；SAO4000 mg/kg 組存活小鼠的心、肝和腎的臟器系數(shù)與正常對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但脾的臟器系數(shù)明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 蘆筍老莖皂苷對(duì)小鼠攝食量和飲水量的影響（）Tab.2 Effect of SAO on food and water consumption of mice in different groups （）

表2 蘆筍老莖皂苷對(duì)小鼠攝食量和飲水量的影響（）Tab.2 Effect of SAO on food and water consumption of mice in different groups （）

與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

2.6 SAO 對(duì)小鼠血糖和血脂水平的影響

SAO 對(duì)小鼠血糖和血脂水平的影響見(jiàn)表4，與正常對(duì)照組相比，500 mg/kg 的SAO 對(duì)小鼠血清Glu、TC、TG 和HDL-C 水平均無(wú)顯著影響（P＞0.05）；SAO1000 mg/kg 組小鼠的血清TC、TG 和HDL-C 水平與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但血清Glu 水平明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05）；SAO4000 mg/kg 組存活小鼠的血清Glu、TC 和HDL-C 水平與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05），但血清TG 水平明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

表3 蘆筍老莖皂苷對(duì)小鼠主要臟器系數(shù)的影響（）Tab.3 Effect of SAO on organ coefficient of mice in different groups （）

表3 蘆筍老莖皂苷對(duì)小鼠主要臟器系數(shù)的影響（）Tab.3 Effect of SAO on organ coefficient of mice in different groups （）

與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

表4 蘆筍老莖皂苷對(duì)小鼠血糖和血脂水平的影響［（），mmol/L］Tab.4 Effect of SAO on serum glucose and lipid levels of mice in different groups ［（），mmol/L］

表4 蘆筍老莖皂苷對(duì)小鼠血糖和血脂水平的影響［（），mmol/L］Tab.4 Effect of SAO on serum glucose and lipid levels of mice in different groups ［（），mmol/L］

與正常對(duì)照組比較，*P ＜0.05。

3 討論

急性毒性試驗(yàn)是指對(duì)動(dòng)物一次或24 h 內(nèi)多次給藥，觀(guān)察動(dòng)物的中毒癥狀和死亡情況，從而初步評(píng)價(jià)受試物的毒性及主要靶器官，是新藥安全性評(píng)價(jià)的第一步[16-17]。本試驗(yàn)采用ICR 小鼠進(jìn)行SAO 經(jīng)口給藥的急性毒性試驗(yàn)，結(jié)果表明SAO 的LD50為3 460 mg/kg，根據(jù)聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織推薦的五級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于低毒性，且筆者前期的研究表明40 mg/kg 的SAO 即有明顯的降血脂和降血糖作用[9-11]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SAO 的LD50。

試驗(yàn)期間所有觀(guān)察到的小鼠死亡均發(fā)生在給藥后2 h 內(nèi)，根據(jù)小鼠的毒性反應(yīng)和死亡時(shí)間，推測(cè)SAO 具有一定的神經(jīng)毒性。500 mg/kg 和1000 mg/kg 的SAO 對(duì)小鼠的體質(zhì)量、攝食量和飲水量均無(wú)顯著影響，但SAO 4000 mg/kg 組存活小鼠的體質(zhì)量和飲水量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05），但具體的原因還有待進(jìn)一步研究；臟器系數(shù)是評(píng)價(jià)藥物對(duì)臟器影響狀況的重要指標(biāo)，可在一定程度上反映藥物毒副作用的靶器官[18-19]。脾臟是機(jī)體內(nèi)重要的免疫器官，在造血及各種免疫活動(dòng)中均起到重要作用，脾臟指數(shù)的變化可以反映機(jī)體免疫功能的狀態(tài)[18-19]。500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的SAO 對(duì)小鼠的主要臟器系數(shù)無(wú)顯著影響，但SAO 4 000 mg/kg 組存活小鼠脾臟的臟器系數(shù)明顯低于正常對(duì)照組小鼠（P＜0.05），說(shuō)明該劑量的SAO 對(duì)小鼠的脾臟具有一定的毒性，致使脾臟有所萎縮，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。500 mg/kg 和1 000 mg/kg 的SAO 對(duì)小鼠的血清TC、TG 和HDL-C 水平無(wú)明顯影響，但與正常對(duì)照組相比，SAO 1 000 mg/kg 組小鼠血清Glu 明顯降低，SAO 4 000 mg/kg 組小鼠血清TG明顯降低，這可能與SAO 的降血糖和降血脂作用有關(guān)，但具體原因還需深入研究。

研究為蘆筍老莖皂苷的安全性評(píng)價(jià)和深入開(kāi)發(fā)利用提供參考，但若要全面評(píng)價(jià)其安全性，還需要進(jìn)行長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。