孫孔春 ，陳興龍，楊璨瑜，于浩飛，胡煒彥，王 蕊，沈報(bào)春，張榮平

（1） 昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2） 法醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650500；3） 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500）

工業(yè)大麻（Cannabis sativa L.） 為一年生草本植物，又名大麻、漢麻、火麻[1]，主要應(yīng)用于食品、制藥、紡織、化妝品等行業(yè)。其中的大麻二酚（CBD） （結(jié)構(gòu)式見圖1） 是大麻中的非毒性和非成癮性成分，能阻礙THC 對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)的不利影響，是大麻酚類物質(zhì)中最重要的生理活性成分之一，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其對(duì)于抗焦慮，鎮(zhèn)痛、抗失眠、阿爾茨海默病和抗驚厥[2-7]等有一定療效。在工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)合法化的同時(shí)，分析測(cè)定大麻二酚的含量并考察其在提取前處理過程中不同條件對(duì)其含量變化的影響，對(duì)于在工業(yè)生產(chǎn)中大麻二酚的提取具有極其重要的意義。

本文建立了HPLC 分析測(cè)定CBD 含量的方法，考察CBD 在工業(yè)大麻不同部位，不同烘烤溫度，不同烘烤時(shí)間，不同PH 條件等前處理?xiàng)l件下CBD的含量變化，為工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

圖1 大麻二酚結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structural formula of Cannabidiol

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

島津LC-2010A 高效液相色譜儀，島津SPD-M10AVP 檢測(cè)器，島津LC solution 色譜工作站；色譜柱：InertSustain C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；電子天平（BSA124S）：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超聲清洗儀（SK3200H）：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；0.22 μm 尼龍微孔濾頭：天津市津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司；一次性使用無菌注射器5 mL、2.5 mL：陜西龍康鑫醫(yī)療器械有限公司；20 μL、100 μL、200 μL 及1 000 μL移液槍：Eppendorf Research plus。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品及試劑

甲醇（分析純，江蘇漢邦科技有限公司）、超純水（超純水儀，倍捷科技有限公司），大麻二酚對(duì)照品（西安百川生物科技有限公司生產(chǎn)）；工業(yè)大麻（云麻七號(hào)，云南森牧源生物科技有限公司）。

1.3 對(duì)照品及供試品溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液的配制 取CBD 對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇配成濃度為100 μg/mL 對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的配制 分別稱取各大麻供試品約0.2 000 g，于試管中加入約8 mL 正己烷-乙酸乙酯（V/V 9:1） 溶液，超聲5 min，靜置90 min，離心15 000 r/min，10 min，收集上清液至10 mL 容量瓶中，定容，搖勻，備用。

1.4 方法學(xué)研究

1.4.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18 柱（4.6×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：220 nm；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；以甲醇-水（85：15） 為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫。在此色譜條件下，取CBD 對(duì)照品和工業(yè)大麻樣品分別進(jìn)樣分析。

1.4.2 線性關(guān)系的考察 精確稱取CBD 對(duì)照品，照1.3.1 下方法配制得到100 μg/mL 的對(duì)照品溶液，再按1.4.1 下色譜條件分別進(jìn)樣1、5、10、20、50 μL，記錄保留時(shí)間和峰面積。

1.4.3 精密度和重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取1.3.1 下方法配制的同一份供試樣品溶液，按1.4.1 下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄CBD 保留時(shí)間及峰面積；取同一份供試藥材工業(yè)大麻，按1.3.2 下方法平行操作制備5 份樣品，分別按1.4.1 下色譜條件進(jìn)樣，記錄CBD 保留時(shí)間及峰面積，計(jì)算各物質(zhì)保留時(shí)間和峰面積的RSD%，分別考察該方法的精密度和重復(fù)性。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.3.2 下方法配制供試樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 按1.4.1 下色譜條件進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，記錄CBD 保留時(shí)間及峰面積，計(jì)算各物質(zhì)的保留時(shí)間和峰面積的RSD%。

1.4.5 加樣回收率 向已知大麻二酚含量的工業(yè)大麻樣品供試品中，精密加入一定量的CBD 對(duì)照品，計(jì)算實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，再除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。

1.5 樣品含量測(cè)定

取分別經(jīng)不同烘烤溫度，不同烘烤時(shí)間，不同PH 處理后的工業(yè)大麻樣品，按1.3.2 下方法配制成供試品溶液，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀，記錄保留時(shí)間及峰面積，將所得結(jié)果帶入CBD 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算工業(yè)大麻樣品中CBD 的含量。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)研究結(jié)果

2.1.1 工業(yè)大麻中CBD 及樣品HPLC 色譜圖 按1.3.1項(xiàng)下方法配制對(duì)照品溶液，按1.4.1 下色譜條件進(jìn)樣，記錄CBD 對(duì)照品色譜圖（圖2）；按1.3.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，取按1.4.1 下色譜條件進(jìn)樣，記錄工業(yè)大麻樣品色譜圖（圖3）。

圖2 CBD 對(duì)照品色譜圖Fig.2 The chromatogram of cannabidiol reference substance

圖3 工業(yè)大麻樣品色譜圖Fig.3 The chromatogram of Industrial hemp sample

2.1.2 線性關(guān)系 按1.4.2 下方法操作，將結(jié)果以質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到CBD 線性回歸方程為：Y=4×106x+17126，相關(guān)系數(shù)R2=0.9990，在0.000 1～0.005 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn) 按1.4.3 下方法操作，記錄峰面積，精密度實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到工業(yè)大麻中CBD 峰面積的RSD%為0.11%，結(jié)果表明儀器精密度和操作精密度良好；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到工業(yè)大麻中CBD 峰面積的RSD%為0.41%，符合規(guī)定，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.4.4 下方法操作，記錄峰面積，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到工業(yè)大麻中CBD 峰面積的RSD%為0.88%，結(jié)果表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率 按1.4.5 下方法操作，記錄峰面積，計(jì)算得到工業(yè)大麻中CBD 峰加樣回收率，具體結(jié)果見表1，加樣回收率在范圍內(nèi)，結(jié)果表明方法準(zhǔn)確度可靠。

2.2 含量測(cè)定結(jié)果

按1.5 下方法操作，記錄保留時(shí)間及峰面積，將所得結(jié)果帶入CBD 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算經(jīng)不同烘烤溫度，不同烘烤時(shí)間，不同pH 條件處理后工業(yè)大麻中CBD 的含量，結(jié)果表明：工業(yè)大麻的大麻葉子中CBD 含量較高，且在120 ℃條件下，烘烤40 min 條件下能夠明顯提高大麻葉中CBD 的含量，強(qiáng)堿條件對(duì)CBD 的穩(wěn)定性造成影響。具體結(jié)果詳見表2～7，大麻葉在不同烘烤溫度下CBD 含量變化見圖4。

進(jìn)一步細(xì)化時(shí)間點(diǎn)，采取直接放入樣品再升溫烘烤或者升溫后再放入樣品烘烤兩種方式，以5 min 為時(shí)間單位，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，測(cè)定CBD含量，結(jié)果表明：兩種烘烤方式對(duì)大麻葉中CBD含量影響不大，在40 min 時(shí)用CBD 含量較高，詳細(xì)結(jié)果見表5～6。

取約1 mg CBD 樣品，加乙醇溶解，分別用鹽酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH 為1，7，和11，放置0，5 和15d 考察不同pH 值對(duì)CBD 含量的影響，結(jié)果見表7。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The result of recovery rate test

表2 大麻葉、種子以及莖中CBD 含量測(cè)定結(jié)果Tab.2 The results of CBD determination in cannabis leaves，seeds and stems

表3 大麻葉在不同烘烤溫度下CBD 含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 The results of CBD determination of cannabis leaves at different baking temperatures

表4 大麻葉在120 ℃時(shí)的不同烘烤時(shí)間下CBD 含量測(cè)定結(jié)果Tab.4 The results of CBD determination of cannabis leaves at different baking times at 120℃

表5 直接放入大麻葉樣品再升溫至120 ℃烘烤后的不同時(shí)間點(diǎn)下CBD 含量測(cè)定結(jié)果Tab.5 The results of CBD content measurement at different time points after the cannabis leaf samples were directly placed and heated to 120 ℃

表6 升溫至120 ℃再放入大麻葉樣品烘烤后的不同時(shí)間點(diǎn)下CBD 含量測(cè)定結(jié)果Tab.6 The results of determination of CBD content at different time points after heating to 120 ℃and placing in cannabis leaf samples after baking

表7 CBD 在不同pH 條件以及不同放置時(shí)間下的含量測(cè)定結(jié)果Tab.7 The determination results of CBD under different pH conditions and different storage times

圖4 大麻葉在不同烘烤溫度下CBD 含量變化圖Fig.4 The changes of CBD content in hemp leaves at different baking temperatures

3 討論

由表2 可得：工業(yè)大麻的大麻葉、種子以及莖中CBD 含量差別較大，在CBD 提取過程中應(yīng)該選取葉子，盡量避免摻入種子和莖。

由表3 可得：將工業(yè)大麻葉在不同溫度下烘烤30 min，測(cè)定其中CBD 的含量，研究結(jié)果表明以一定的溫度對(duì)大麻葉進(jìn)行烘烤能夠提高大麻葉中CBD 的含量，并且以120 ℃的溫度進(jìn)行烘烤含量提高最明顯。

由表4 可得：將工業(yè)大麻葉在120 ℃的條件下，選擇不同烘烤時(shí)間，對(duì)其CBD 含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在烘烤40 min 的時(shí)候CBD 含量最高，說明烘烤時(shí)間對(duì)CBD 的含量造成了一定影響。

由表5、表6 可得：采取直接放入樣品再升溫烘烤或者升溫后再放入樣品烘烤兩種方式，以5 min 為時(shí)間單位，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣，發(fā)現(xiàn)兩種烘烤方式對(duì)大麻葉中CBD 含量影響不大，均在40 min 時(shí)用CBD 含量最高。以上研究結(jié)果表明在120℃條件下，烘烤40 min 能夠明顯提高大麻葉中CBD 的含量。

由表7 可得：測(cè)定結(jié)果表明pH 值會(huì)對(duì)CBD的穩(wěn)定性造成影響，且強(qiáng)堿性條件的影響更為明顯，隨著時(shí)間的推移，CBD 逐漸降解。

本實(shí)驗(yàn)參考大麻二酚含量測(cè)定的相關(guān)文獻(xiàn)[8]，建立HPLC 法測(cè)工業(yè)大麻中大麻二酚的含量，由圖2 可以看出，大麻二酚保留時(shí)間為8.982 min，該法可簡單、快速測(cè)定工業(yè)大麻中大麻二酚的含量。

大麻二酚在大麻葉中含量較高，于烘烤溫度為120 ℃時(shí)，烘烤40 min 條件下能夠明顯提高大麻葉中CBD 的含量，且大麻二酚在強(qiáng)堿性條件下易降解為其它物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)為工業(yè)中提取大麻二酚處理過程提供技術(shù)依據(jù)。