孟廣燕，陳雪峰,2*，劉歡，蔡國強，趙圓圓，黨玥，朱蓉靜，桑聰

1(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)2(陜西科技大學(xué)，陜西省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安，710021) 3(西安培華學(xué)院，陜西 西安，710021)4(中國人民解放軍94162部隊79分隊，陜西 西安，710021)

發(fā)菜，學(xué)名發(fā)狀念珠藻(Nostocflagelliforme)，屬藍(lán)細(xì)菌門(Cyanopyhta)、藍(lán)細(xì)菌綱(Cyanophyceae)、斷殖藻目(Hormogonales)、念珠藻科(Nostocaceae)、念珠藻屬(Nostoc)[1]。發(fā)菜是陸生藍(lán)藻的一種，藻絲體有多個形如念珠的細(xì)胞，藻絲體外包裹膠質(zhì)鞘，它是原核藍(lán)藻，生長環(huán)境惡劣，有極強生命力，能夠在逆性環(huán)境下正常生長[2]。自然缺水時，發(fā)菜呈黑色細(xì)絲狀，交纏成團(tuán)，形如發(fā)絲，得名發(fā)菜。在全球均有發(fā)菜分布[3]，它主要生長在干旱、半干旱地區(qū)的草原和荒漠及半荒漠地帶，發(fā)菜在我國的分布也較廣泛。它起源于古老的光能自養(yǎng)型低等植物，能夠自給自足，有固氮特性[4]，同時發(fā)菜能夠耐高低溫、抗干旱，有很強的自我調(diào)節(jié)能力[5]。發(fā)菜可以食用，在我國，發(fā)菜作為食物已有大約2 000年的歷史，其營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)及錳、鐵、鈣等多種微量元素。焦文東[6]通過研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜中必需氨基酸、多不飽和脂肪酸含量都較高，因此可以作為優(yōu)質(zhì)蛋白和二十二碳六烯酸(docosahexaenoid acid，DHA)的良好來源[7]。發(fā)菜在生長過程中會分泌活性胞外多糖[8]，有很高的生物活性，能夠保護(hù)細(xì)胞[9]，發(fā)菜的食用和藥用價值主要歸功于胞外多糖的存在[10]。但也正是因此，近些年人們對其濫采亂挖，再加上發(fā)菜本身生長環(huán)境的破壞、土地鹽漬化問題加劇、發(fā)菜培養(yǎng)不易、自然狀態(tài)下生長慢等諸多因素，發(fā)菜的年產(chǎn)量越來越低。1999年，國務(wù)院正式批準(zhǔn)將野生發(fā)菜列為國家二級保護(hù)野生植物，并從2000年7月起嚴(yán)令禁止對野生發(fā)菜的隨意開采和交易[11]。

王貴春[12]通過大量研究得出結(jié)論，發(fā)菜在0.3 mol/L鹽濃度下培養(yǎng)一段時間后比在正常條件時產(chǎn)生的胞外多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了50.3%。趙秀霞等[13]分別測定了正常條件下培養(yǎng)的發(fā)菜細(xì)胞和0.3 mol /L鹽濃度培養(yǎng)的發(fā)菜細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組序列[14]，在此項研究中他們共測出 13 170 條基因的表達(dá)水平出現(xiàn)了一定變化[15]，有些基因的表達(dá)水平上調(diào)，也有表達(dá)水平下調(diào)的基因。他們又對這些表達(dá)水平出現(xiàn)變化的基因進(jìn)行了GO功能聚類[16]和Pathway的代謝通路分析[17]，在此項研究中發(fā)現(xiàn)參與發(fā)菜細(xì)胞的主要鹽離子運輸、光合作用、部分代謝以及各種代謝產(chǎn)物生物合成等眾多過程的基因的表達(dá)都有一定的改變[18]。本研究以在不同鹽濃度下表達(dá)量變化比較明顯的鉀離子通道蛋白TrKA-N基因作為目的基因，從路苗等[19]的研究結(jié)果中可以得出結(jié)論，鉀離子通道蛋白TrKA-N基因是影響鹽脅迫下多糖分泌量的關(guān)鍵基因之一，通過分子生物學(xué)手段[20]克隆得到鉀離子通道蛋白TrKA-N的全基因序列[21]，軟件推譯得到該蛋白的氨基酸序列，通過各種軟件分析該氨基酸編碼蛋白的種類和功能，將該基因與表達(dá)載體連接后，誘導(dǎo)基因成功在適當(dāng)條件下合成具有相應(yīng)功能的蛋白質(zhì)。本研究為發(fā)菜響應(yīng)鹽脅迫相關(guān)基因及其代謝調(diào)控機理的研究提供了一些思路，為各種蛋白基因工程菌株的成功構(gòu)建[22]打下了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用發(fā)菜，由本實驗室自行液體懸浮培養(yǎng)；表達(dá)載體質(zhì)粒，由微生物實驗室-80 ℃保藏；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及其他實驗相關(guān)試劑，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；專用試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C-1全溫振蕩器，太倉市實驗設(shè)備(蘇州培英實驗設(shè)備有限公司)；MGC-400型光照培養(yǎng)箱，上海善志儀器設(shè)備有限公司；DYY-2C型電泳儀，北京六一儀器廠；ETC811基因擴增儀，蘇州東勝儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)

BG11培養(yǎng)基配置[23]：硅液為5.8 g/L Na2SiO3·9H2O；磷液為2.38 g/L K2HPO4·2H2O；母液A1為3.6 g/L CaCl2·2H2O；母液A2為7.5 g/L MgSO4·7H2O；母液B成分(g/L)：檸檬酸，6.00；EDTA·2Na，1.00；CoCl2，0.01；CuSO4·5H2O，0.08；ZnSO4·7H2O，0.2；NaMoO4·2H2O，0.4；MnCl2·4H2O，1.8；H3BO3，2.86；FeSO4·7H2O，4.8。

培養(yǎng)基處理：取母液A1、A2各5 mL、母液B 500 μL于燒杯，定容到300 mL，移入錐形瓶1； Si液、P液各取5 mL，定容至200 mL，移入錐形瓶2。將瓶1和瓶2分別封口后高溫滅菌(121 ℃，20 min)[24]。滅菌后把培養(yǎng)基放到凈化工作臺中，降至室溫，在工作臺中將瓶1和瓶2混合均勻，以200 mL/瓶的量分裝至錐形瓶。發(fā)菜細(xì)胞轉(zhuǎn)接量為10%，培養(yǎng)箱設(shè)置兩段式條件循環(huán)培養(yǎng),第一段為30 μmol/(m2·s)光照， 25 ℃培養(yǎng)12 h； 第二段為0 μmol/(m2·s)光照， 10 ℃培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)15 d左右，可以進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3.2 目的蛋白基因TA克隆及序列測定

參照購買的植物基因組提取純化試劑盒說明書提取發(fā)菜基因組 DNA，質(zhì)量檢測后于-20 ℃冰箱保藏待用[25]。

通過功能注釋、代謝通路分析及美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫比對，篩選出鉀離子通道蛋白TrKA-N基因，同源比對發(fā)現(xiàn)該基因與點狀念珠藻鉀離子通道蛋白TrKA-N基因的相似度為92.41%。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與NCBI相似基因序列同源比對分析后設(shè)計引物，并在上下游引物分別加入BamH I和XhoI的酶切位點，最終設(shè)計引物為上游引物ATF：5′-CGCGGATCCGTGAATCTTTCATCATTAAGT-3′，下游引物ATR：5′-CCGCTCGAGAATCCGGCAAACGATTGATAT-3′，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。20 μL PCR 反應(yīng)體系為發(fā)菜DNA 2 μL，設(shè)計合成的上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，超純水6 μL。PCR條件為95 ℃反應(yīng)5 min，95 ℃反應(yīng)30 s，50 ℃，30 s，72 ℃反應(yīng)2 min，重復(fù)反應(yīng)30次，72 ℃反應(yīng)5 min。反應(yīng)完成后，電泳檢測純化后產(chǎn)物與pMD19-T載體重組。將重組基因轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，菌液進(jìn)行PCR驗證成功后，擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，質(zhì)粒送至北京奧科鼎盛生物科技公司測序。

1.3.3 序列分析

將測序序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST比對，確認(rèn)基因信息，用DNAMAN推譯出相應(yīng)氨基酸序列，再用DNAstar和ProtParam進(jìn)行分析，利用TMHMM分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)，用ProtScale分析該蛋白的親水性及疏水性，分別用DNAMAN 和SOPMA分析預(yù)測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，用NetPhos3.1 Server分析該蛋白的磷酸化位點及個數(shù)。

1.3.4 TrkA-N鉀通道蛋白基因原核表達(dá)

參考測序結(jié)果，重新設(shè)計引物，并且在上下游引物的 5′端分別添加BamH I 和XhoI的酶切位點及保護(hù)堿基，最終設(shè)計引物為上游引物ATF1:5′-GGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGTGAATCTTTCATCA-TTAAGT-3′，下游引物ATR1:5′-CGACGGAGCTCGA-ATTCGGATCCAATCGGCAAACGATTGATAT-3′，合成引物后，以重組質(zhì)粒為模板，PCR擴增體系與前面實驗一致，退火溫度改為52 ℃，其他條件不變。擴增完成后檢測并純化產(chǎn)物，產(chǎn)物和pET28a質(zhì)粒分別用2種酶BamH I 和XhoI做雙酶切反應(yīng)，然后連接2個片段，連接成功的重組基因就是蛋白基因表達(dá)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α培養(yǎng)，挑選陽性克隆進(jìn)行菌液PCR及雙酶切驗證，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的蛋白基因TA克隆

抽提發(fā)菜DNA，電泳30 min，結(jié)果如圖1-a所示，提取的發(fā)菜DNA條帶清晰，沒有雜帶，說明其質(zhì)量較好。目的基因體外擴增反應(yīng)的電泳結(jié)果如圖1-b所示，在預(yù)期大小的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)附近(700 bp)有特異條帶，說明實驗正確。TrkA-N鉀通道蛋白基因連接pMD19-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后的菌液PCR電泳結(jié)果如圖1-c所示，克隆位點大小是140 bp，加上目的基因700 bp左右，在800 bp左右出現(xiàn)特異清晰條帶，說明結(jié)果正確，即發(fā)菜的TrkA-N鉀通道蛋白基因與pMD19-T載體連接成功，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。

a-發(fā)菜DNA電泳圖；b-鋰離子通道蛋白TrkA-N基因的PCR擴增；c-鉀離子通道蛋白TrkA-N基因重組質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化(DH5a/AT)PCR驗證圖1-a：泳道M-分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)λDNA HindⅢ，泳道1～3-發(fā)菜DNA；圖1-b：泳道M-分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)D2000，泳道1-目的基因；圖1-c：泳道M-分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)D2000，泳道1-成功重連的產(chǎn)物條帶圖1 發(fā)菜DNA提取、目的基因體外擴增及重組質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化驗證Fig.1 DNA extraction, PCR amplification of the target gene in vitro and positive transformation of recombinant plasmids were verified

2.2 目的蛋白核酸及氨基酸序列分析

2.2.1 核苷酸及氨基酸序列

鉀離子通道蛋白TrkA-N基因與pMD19-T載體成功連接后，用pMD19-T載體通用引物對其雙向測序，結(jié)果如圖2所示，發(fā)菜鉀離子通道蛋白TrkA-N基因片段大小為696 bp，推譯得到的氨基酸序列表明，該蛋白共有231個氨基酸，DNAstar分析可知，帶電荷的氨基酸有55個，占總氨基酸殘基個數(shù)的23.81%，其中25個帶正電荷，30個帶負(fù)電荷。極性氨基酸有53個，占22.94%。疏水性氨基酸92個，占39.83%，酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占13.42%和10.82%。在鉀離子通道蛋白TrkA-N中包含較多的氨基酸為 Leu(10.8%)、Val(10.0%)、Ala (7.8%)和Gly(6.9%)，其不穩(wěn)定值為34.74(<40)，說明鉀離子通道蛋白TrkA-N為穩(wěn)定蛋白。

圖2 鉀離子通道蛋白TrkA-N基因核苷酸及氨基酸序列Fig.2 Nucleic acid and amino acid sequence of potassium channel protein TrkA-N gene

用DNAMAN把目的蛋白的核苷酸序列和它對應(yīng)的氨基酸(amino acid，AA)序列與NCBI數(shù)據(jù)庫里的同源物種比對，結(jié)果如圖3所示，通過分析比對發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜鉀離子通道蛋白TrkA-N基因保守性較高，核苷酸序列與念珠藻(Nostocsp.′Peltigera membranacea cyanobiont N6′)的相似度為93.25%，與點狀念珠藻(NostocpunctiformePCC73102)的相似度為92.41%，與念珠藻(NostoclinckiaNIES-25)的相似度為90.12%，與筒孢藻(Cylindrospermumsp. NIES-4074)的相似度為85.42%，與絲狀藍(lán)藻(Calothrixsp. NIES-2098)的相似度為84.23%，(Anabaenasp. WA102)的相似度為84.02%，與絲狀藍(lán)藻(Calothrixsp. PCC 7507)的相似度為83.59%。

目的蛋白的AA序列在進(jìn)化過程中的變化很小(圖4)，通過分析比對發(fā)現(xiàn)，發(fā)菜鉀離子通道蛋白TrkA-N序列具有較高的保守性，AA序列與點狀念珠藻(NostocpunctiformePCC73102)的相似度為96.86%，與念珠藻(Nostocsp. KVJ20)的相似度為96.32%，與念珠藻(Nostoclinckia)的相似度為94.12%，與念珠藻(Nostoccalcicola)的相似度為93.32%，與念珠藻(Nostocsp. T09)的相似度為91.78%，與眉藻(Calothrixsp. PCC 7507)的相似度為91.12%，與柱孢藻(Cylindrospermumstagnale)的相似度為90.31%，與魚腥藻(Anabaenasp. 90)的相似度為89.67%，與眉藻(Calothrixsp. NIES-2098)的相似度為90.12%，與魚腥藻(Anabaenasp. AL09)的相似度為89.23%。

圖3 鉀離子通道蛋白TrkA-N核苷酸序列進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of ptassium channel protein TrkA-N nucleotide sequence

圖4 鉀離子通道蛋白TrkA-N氨基酸序列進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of ptassium channel protein TrkA-N amino acid sequence

2.2.2 鉀離子通道蛋白TrkA-N基因分析及性能預(yù)測

利用軟件ExPASy檢測目的蛋白的疏水性，結(jié)果如圖5所示，第15位精氨酸(Arg)親水性最強，第85位異亮氨酸(Ile)疏水性最強，該蛋白的親水性區(qū)間多于疏水性區(qū)間，因此確定鉀離子通道蛋白TrkA-N為親水性蛋白。

圖5 鉀離子通道蛋白TrkA-N疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of potassium channel protein TrkA-N

利用 TMHMM 程序?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行跨膜區(qū)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)分析顯示，該蛋白不含跨膜區(qū)。

利用NetPhos3.1 Server分析目的蛋白的磷酸化位點及位點個數(shù)，結(jié)果顯示，目的蛋白氨基酸序列中磷酸化位點個數(shù)分別為酪氨酸2個，蘇氨酸6個，絲氨酸10個。

通過2個軟件DNAMAN和SOPMA分析預(yù)測目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)，雖然2個軟件分析的方式不同，給出結(jié)果的形式不同，但是最終得出的結(jié)論一致(表1)，即蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為β折疊和α螺旋。

表1 發(fā)菜鉀離子通道蛋白TrkA-N二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Table 1 Prediction results of TrkA-N secondary structure of potassium channel protein in Nostoc flagelliforme

2.3 鉀離子通道蛋白TrkA-N在大腸桿菌中的表達(dá)

構(gòu)建目的蛋白基因的表達(dá)載體pET28a-TrkA-N potassium channel protein gene，然后轉(zhuǎn)化 DH5α 挑選陽性克隆，在液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR驗證，得到1 000 bp左右的特異條帶(加上克隆位點300 bp左右)，如圖6所示。抽取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切驗證反應(yīng)，電泳后可以看到兩條比較清晰的條帶，大小分別在700 bp和5 000 bp左右，與預(yù)期大小一致(圖7)。測序結(jié)果表明插入片段就是鉀離子通道蛋白TrkA-N基因。

泳道M-分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)D2000；泳道1-鉀離子通道蛋白TrkA-N基因重連產(chǎn)物圖6 目的蛋白基因重組質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化的PCR驗證Fig.6 PCR identification of positive transformant

泳道M-分子質(zhì)量標(biāo)尺D15 000+2 000；泳道1-目的蛋白基因的雙酶切圖7 鉀離子通道蛋白TrkA-N基因重組質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子的酶切驗證Fig.7 Enzymatic digestion of recombinant plasmid positive inverters of potassium channel protein TrkA-N gene

將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21細(xì)胞，挑選陽性菌接種到含有卡那霉素的 LB 培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)，10 h后每隔1 h測定1次菌液OD600值，OD值達(dá)到0.8時，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isoproyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，保證其終濃度為1 mmol/L，對照組分別為加了IPTG且終濃度為1 mmol/L的pET-28a空質(zhì)粒菌和沒有加IPTG的陽性菌，37 ℃，120 r/min培養(yǎng)20 h后取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖8所示，表明有我們預(yù)期的外源蛋白表達(dá)，目的蛋白分子質(zhì)量為31.41 kDa，外源蛋白分子質(zhì)量與預(yù)測的目的蛋白分子質(zhì)量相符，說明鉀離子通道蛋白TrkA-N表達(dá)成功。

泳道M-基因表達(dá)驗證參考10～180 kDa；泳道1-1 mmol /LIPTG誘導(dǎo)20 h的空白質(zhì)粒；泳道2-不加誘導(dǎo)劑的陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子；泳道3-1 mmol /L IPTG誘導(dǎo)20 h的目標(biāo)質(zhì)粒圖8 鉀離子通道蛋白TrkA-N基因在大腸桿菌BL21中的表達(dá)Fig.8 Expression of TrkA-N potassium channel protein in E.coli BL21

3 結(jié)論與討論

隨著土地鹽漬化問題的加劇，鹽脅迫問題已經(jīng)成為了一個非常常見的非生物脅迫，在一定濃度的鹽脅迫作用下，發(fā)菜細(xì)胞的胞外多糖產(chǎn)量增加，其內(nèi)在因素是發(fā)菜中與鹽脅迫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了一些不同程度的改變，一部分基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，另一部分基因表達(dá)水平下降，其中鉀離子通道蛋白TrkA-N基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了較明顯的下調(diào)，說明該基因可能是參與一定鹽濃度作用下胞外多糖代謝過程重要的基因之一，可能在發(fā)菜鹽脅迫作用下的一些相關(guān)反應(yīng)中發(fā)揮了比較重要的作用。鉀離子通道蛋白TrkA-N基因可以參與多糖合成，也驗證了發(fā)菜可以通過改變一些基因的轉(zhuǎn)錄水平對鹽脅迫做出相應(yīng)緩解作用的反應(yīng)，該結(jié)果從分子水平解釋了鹽脅迫下發(fā)菜多糖產(chǎn)量提高的調(diào)控機理，為該結(jié)論提供了有力的依據(jù)。本研究利用分子生物學(xué)方法體外擴增鉀離子通道蛋白TrkA-N編碼基因，與pET28a質(zhì)粒重連構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)表達(dá)，最佳表達(dá)條件為液體培養(yǎng)10 h后待菌液OD600值達(dá)到0.8時，添加終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)劑 IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)20 h，最終在大腸桿菌中成功表達(dá)出分子質(zhì)量為31.41 kDa的蛋白，本實驗在成功構(gòu)建表達(dá)載體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步摸索出誘導(dǎo)目的基因在該載體中成功表達(dá)的最優(yōu)條件，為更多基因的研究提供了較成熟的研究思路，也為更深入的研究打下了良好基礎(chǔ)。然而，正如前文所說，參與鹽脅迫反應(yīng)的基因還有很多，在該作用下多糖產(chǎn)量變化的過程和機制也相當(dāng)復(fù)雜，因此，要研究的基因以及這些基因編碼蛋白質(zhì)的種類及功能還有很多，它們在鹽脅迫下的響應(yīng)機理以及調(diào)控多糖代謝機制還需進(jìn)一步研究。