王浩，李海濤

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上第四大致命性癌癥，每年有近90萬人因此死亡[1]，死亡率呈上升態(tài)勢，且發(fā)病趨于年輕化[2]，一項人群調(diào)研的結(jié)果表明，在被調(diào)查對象中，40～49歲的CRC患者占50歲以下患者的75%[3]。影響CRC發(fā)病的因素復(fù)雜，越來越多報道表明飲食[4]、腸道菌群[5]甚至生物鐘[6]等會對CRC的發(fā)病及預(yù)后產(chǎn)生一定影響。異常的代謝水平是惡性腫瘤的一個重要標(biāo)志，腫瘤細(xì)胞更傾向通過糖酵解途徑來對葡萄糖代謝利用，且對葡萄糖攝取及乳酸產(chǎn)出有著較強的能力，即“Warburg效應(yīng)”[7]。對此，異常的葡萄糖代謝在一定程度上，對癌癥化療中的耐藥性提供了一定的解釋，也有望成為一個治療的靶點[8]。單糖對腫瘤的影響近年來備受矚目，一項研究表明，給予Apc-/-小鼠高玉米糖漿飲食(果糖與葡萄糖組合)可以加強糖酵解，從而顯著性促進(jìn)結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生與發(fā)展程度[9]。但葡萄糖并不是唯一影響腫瘤生長的單糖，另一項研究表明，在體外額外攝入甘露糖和巖藻糖可以延緩多種腫瘤細(xì)胞的增殖，前者尤為顯著[10]。

甘露糖是一種天然單糖，來源廣泛，從植物和微生物中都可以提取，其與葡萄糖互為差向異構(gòu)體，且二者有著相同的轉(zhuǎn)運載體GLUT1，這或許對細(xì)胞葡萄糖的攝取及代謝產(chǎn)生影響。GLUT1主要負(fù)責(zé)將葡萄糖向紅細(xì)胞中擴散以及向大腦和其他器官輸送，但其表達(dá)量則是癌癥患者的重要預(yù)后指標(biāo)[11]，一項跨越23年的研究表明，GLUT1的過表達(dá)與大多數(shù)實體瘤患者的低生存率相關(guān)[12]，因此，通過干擾結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞的GLUT1表達(dá)，有望成為一個治療手段[13]。

一項人群研究表明，將甘露糖混入飲食，受試者出現(xiàn)了葡萄糖吸收下降的癥狀[14]。這種影響葡萄糖吸收的作用，也可能會對結(jié)直腸腫瘤產(chǎn)生類似的效果。但目前尚未有關(guān)于甘露糖對結(jié)直腸腫瘤GLUT1表達(dá)及葡萄糖吸收的影響的報道。本研究以甘露糖為研究對象，以動物模型和細(xì)胞模型為實驗手段，探究甘露糖存在下對結(jié)直腸癌發(fā)生、增殖及癌細(xì)胞對葡萄糖攝取等影響，并對其中的機理進(jìn)行探究。研究成果可為甘露糖用以輔助結(jié)直腸腫瘤病人的救治及高危人群的預(yù)防提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雄性小鼠，6周齡，體重20～22 g，上海靈暢生物科技有限公司。

1.1.2 實驗細(xì)胞

人源結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116及HT29，購自ATCC細(xì)胞庫(The Global Bioresource Center)。

1.1.3 抗體

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1，12939)、己糖激酶-Ⅱ(Hexokinase-Ⅱ，HK-Ⅱ，2867)、內(nèi)參β-Actin(4970)，購自CST(Cell Signaling Technology)。

1.1.4 實驗試劑

MTT細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒，南京森貝伽生物科技有限公司；葡萄糖含量檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司;氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)，無錫萊弗思生物實驗器材有限公司；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodiuln，DSS),南京百斯凱科技有限公司；甘露糖、葡萄糖、果糖及低聚果糖(fructooligosaccharide,FOS),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸腫瘤小鼠模型實驗

6周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠,飼養(yǎng)于江南大學(xué)實驗動物中心SPF屏障環(huán)境，在屏障環(huán)境熟悉1周后，隨機分組。模型組(10只)，干預(yù)組(各7只)接受單次AOM(10 mg/kg)腹腔注射，空白組(7只)及對照組(各4只)注射同體積9 g/L的NaCl水溶液。1周后，模型組和干預(yù)組飲用水更換為質(zhì)量濃度為25 g/L的DSS(分子質(zhì)量為35 000～50 000 Da)飲用水，持續(xù)1周，空白及各對照組始終保持普通飲用水。之后，干預(yù)組和對照組開始灌胃相應(yīng)的糖液，每2 d1次，糖液濃度為20 g/L，每次200 μL，空白及模型組以普通水代替糖液。7周后，根據(jù)動物福利原則處死小鼠后，對結(jié)直腸等器官進(jìn)行分離，40 g/L多聚甲醛-PBS固定及液氮凍存，以備后續(xù)實驗。受試糖為甘露糖、葡萄糖、果糖及FOS。

1.2.2 小鼠結(jié)直腸組織標(biāo)本制作及H&E染色實驗

AOM/DSS誘導(dǎo)原發(fā)結(jié)直腸腫瘤小鼠麻醉處死后，取下結(jié)直腸后，縱剖攤平，緊密卷起后，依次經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋及切片等步驟完成標(biāo)本制作。標(biāo)本依次經(jīng)過烤片、脫蠟、水化、染色、脫水、透明及封片等步驟后，于掃描儀下觀察。

1.2.3 細(xì)胞增殖實驗

將HCT116和HT29細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔1×103個細(xì)胞。過夜后，小心吸取上清液，換上額外含有不同糖的相應(yīng)Dulbecco′s modified eagle medium(DMEM)培養(yǎng)液，F(xiàn)OS質(zhì)量濃度與其他單糖一致。于不同時間點按照試劑盒說明，吸取上清液，加入110 μL MTT試劑，4 h后吸取上清液，加入110 μL顯色液，振蕩混勻10 min后，于570 nm處測定光密度。高糖DMEM培養(yǎng)基含有濃度為25 mmol/L的葡萄糖；低糖DMEM培養(yǎng)基含有濃度為5.56 mmol/L的葡萄糖(更接近人體血糖水平[11])，無糖DMEM培養(yǎng)基不含葡萄糖。受試糖為甘露糖、葡萄糖、果糖及FOS。

1.2.4 細(xì)胞毒性實驗

將HCT116和HT29細(xì)胞分別接種于96孔板，每孔5×103個細(xì)胞。過夜后，小心吸取上清液，換上含有不同濃度甘露糖的低糖(葡萄糖濃度為5.56 mmol/L)DMEM培養(yǎng)液。48 h后吸去上清液，后續(xù)步驟同1.2.3。

1.2.5 培養(yǎng)液葡萄糖消耗量測定

HCT116及HT29細(xì)胞每皿7×105個分別接種于10 cm皿，過夜后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，以穩(wěn)定細(xì)胞代謝，之后換用含有不同濃度甘露糖的低糖(葡萄糖濃度為5.56 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基。分別于24、48 h收集上清，根據(jù)試劑盒說明測定其中葡萄糖下降量，下降量根據(jù)細(xì)胞蛋白濃度做單位均一化處理，后計算變化率。

1.2.6 蛋白提取

對于細(xì)胞樣本，HCT116及HT29細(xì)胞每皿7×105個分別接種于10 cm皿，過夜后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，以穩(wěn)定細(xì)胞代謝。之后換用含有不同濃度甘露糖的低糖(葡萄糖濃度為5.56 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基。12 h后收集培養(yǎng)上清液內(nèi)及貼壁細(xì)胞，1 000 r/min條件下離心5 min后，PBS清洗3次，以洗去殘余培養(yǎng)基，后用含有磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，經(jīng)組織破碎儀充分裂解后，12 000 r/min離心10 min，棄沉淀，吸上清，后根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書對蛋白濃度進(jìn)行測定。加入含有5%(體積分?jǐn)?shù))β-巰基乙醇的5× loading buffer后，于95 ℃下金屬浴10 min，用于蛋白變性；對于小鼠結(jié)直腸組織，每個樣本稱取20 mg，后加入30倍體積含有磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液進(jìn)行裂解，后續(xù)操作同細(xì)胞樣本。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法(western blot)分析

30 μg變性后蛋白樣本經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜，用含有5%體積分?jǐn)?shù)BSA的TBST(TBS溶液，含有體積分?jǐn)?shù)為1%的吐溫-20)封閉1 h，后加一抗(GLUT1、HK-Ⅱ及β-Actin抗體，1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜；一抗孵育后，經(jīng)TBST洗滌(4×5 min)后，二抗孵育1 h(1∶2 000稀釋)后，再經(jīng)TBST洗滌(4×5 min)，最后加入顯影液，顯影觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計分析

平均值±SD用以表示結(jié)果，采用Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計分析，對P<0.05的分析結(jié)果，認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 額外甘露糖攝入降低結(jié)直腸腫瘤發(fā)生率

對于動物實驗，采用經(jīng)典的AOM/DSS誘導(dǎo)的原發(fā)結(jié)直腸腫瘤小鼠模型，并用不同糖液灌胃干預(yù)，圖1為實驗設(shè)計。整個周期平均體重記錄如圖2所示，經(jīng)過7周的灌胃干預(yù)，模型組平均體重為(26.67±3.32) g，甘露糖干預(yù)組為(27.34±1.61) g，葡萄糖干預(yù)組為(27.27±3.70) g，F(xiàn)OS干預(yù)組為(25.63±3.22) g，果糖干預(yù)組為(23.42±3.08) g(P<0.05，與模型組比較，單因素方差分析t檢驗)。由3位具有豐富小鼠結(jié)直腸病理分析經(jīng)驗的實驗人員對小鼠結(jié)直腸腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)進(jìn)行評估，結(jié)果表明甘露糖干預(yù)組腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)顯著小于模型組(P<0.05)，而其他組間無顯著差別(P>0.05)，說明甘露糖具有降低結(jié)直腸腫瘤發(fā)生率的作用(圖3)。我們通過對結(jié)直腸組織進(jìn)行病理學(xué)評估，可以發(fā)現(xiàn)模型組小鼠結(jié)直腸病灶的細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生變化，呈纖維狀，隱窩破壞明顯，有較大腺瘤產(chǎn)生，而甘露糖干預(yù)組結(jié)直腸病灶細(xì)胞變化程度較低，生成腺瘤較小(圖4)，說明實驗劑量下，甘露糖具有一定緩解結(jié)直腸腫瘤發(fā)展的作用。而每種糖的對照與空白組相比，未見異常(P>0.05)。

圖1 動物實驗示意圖Fig.1 Schematic diagram of animal experiment

圖2 動物體重記錄Fig.2 Animal weight record

圖3 腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)Fig.3 Number of tumor nodules注：采用單因素方差分析Mann-Whitney U檢驗。與空白組或模型組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01,***表示P<0.001(下同)

a-空白組；b-模型組；c-甘露糖干預(yù)組圖4 小鼠結(jié)直腸組織病理學(xué)分析Fig.4 Histopathological analysis of colorectal in mice

2.2 甘露糖減緩結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖

我們選取了HCT116和HT29兩株細(xì)胞系來探究甘露糖對結(jié)直腸癌細(xì)胞生長狀況的影響。首先驗證了葡萄糖為2株細(xì)胞系最重要的碳源(圖5)。因此，我們分別在高糖(葡萄糖濃度為25 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基及低糖(葡萄糖濃度為5.56 mmol/L，更接近人體血糖水平[11])DMEM培養(yǎng)基來驗證不同濃度甘露糖對2種細(xì)胞系增殖情況的影響，結(jié)果表明，在2種培養(yǎng)基下，甘露糖都能夠減弱2種細(xì)胞系的增殖，且呈現(xiàn)出時間依賴以及劑量依賴性(圖6、圖7)，因此后續(xù)實驗我們選擇了更為接近人體血糖水平的低糖DMEM培養(yǎng)基作為培養(yǎng)介質(zhì)。

a-HCT116細(xì)胞系；b-HT29細(xì)胞系圖5 HCT116細(xì)胞系及HT29細(xì)胞系碳源分析Fig.5 Analysis of carbon source utilization in HCT116 and HT29注：采用雙因素方差分析Bonferroni檢驗(圖6、圖7同)

a-HCT116細(xì)胞系；b-HT29細(xì)胞系圖6 高糖DMEM培養(yǎng)基中HCT116及HT29增殖分析Fig.6 Analysis of HCT116 and HT29 proliferation in high-glucose DMEM culture

a-HCT116細(xì)胞系；b-HT29細(xì)胞系圖7 低糖DMEM培養(yǎng)基中HCT116及HT29增殖分析Fig.7 Analysis of HCT116 and HT29 proliferation in low-glucose DMEM culture

2.3 甘露糖對結(jié)直腸癌的細(xì)胞毒性實驗

本實驗意在探究在前述實驗劑量下，甘露糖是否由于其對2種細(xì)胞系產(chǎn)生毒性從而造成這種抑制現(xiàn)象。結(jié)果表明，甘露糖對HCT116細(xì)胞系IC50值約為125 mmol/L，對HT29細(xì)胞系IC50值約為110 mmol/L，均遠(yuǎn)大于增殖實驗所用最大劑量(25 mmol/L)(圖8)。因此，甘露糖在增殖實驗中所用的劑量，對HCT116細(xì)胞系及HT29細(xì)胞系的毒性作用較小。

a-HCT116細(xì)胞系；b-HT29細(xì)胞系圖8 甘露糖對HCT116及HT29毒性分析Fig.8 Analysis of cytotoxicity of mannose to HCT116 and HT29注：采用單因素方差分析t檢驗(圖11同)

2.4 甘露糖降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的葡萄糖攝取量

通過對HCT116及HT29兩個細(xì)胞系培養(yǎng)基中葡萄糖消耗量的測定，以細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行均一化后，結(jié)果如圖9所示，甘露糖可以降低兩者培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗量，以25 mmol/L劑量下為例，在48 h時間點降低率達(dá)到了(68.40±3.43)%(HCT116)及(58.78±1.27)%(HT29)。

a-HCT116細(xì)胞系；b-HT29細(xì)胞系圖9 甘露糖對HCT116及HT29葡萄糖攝取的影響Fig.9 Effects of mannose on glucose uptake of HCT116 and HT29

2.5 甘露糖降低結(jié)直腸癌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1表達(dá)

目前，我們觀察到甘露糖能夠干擾HCT116及HT29兩株細(xì)胞系的葡萄糖攝取，因此，我們進(jìn)一步探究甘露糖是否影響結(jié)直腸癌細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1的表達(dá)。通過Western Blot分析，我們發(fā)現(xiàn)，甘露糖的存在能夠降低2株細(xì)胞系的GLUT1表達(dá)，且表達(dá)呈現(xiàn)出劑量負(fù)相關(guān)性，同時我們也觀察到，作為糖酵解的限速酶己糖激酶-Ⅱ(HK-Ⅱ)，表達(dá)量變化不大(圖10)。對各組小鼠結(jié)直腸不同部位進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果表明，與模型組相比，甘露糖干預(yù)組的腫瘤部位的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1表達(dá)顯著性低于模型組(P<0.05)，說明甘露糖的攝入對小鼠結(jié)直腸腫瘤部位葡萄糖的攝取有干擾作用，這和前述細(xì)胞實驗所觀察到的結(jié)果一致，并且可以看出，瘤旁組織HK-Ⅱ的表達(dá)要低于腫瘤病灶處，與此同時，甘露糖干預(yù)組腫瘤病灶的HK-Ⅱ表達(dá)與模型組無顯著性差異(P>0.05)(圖11)。

圖10 HCT116細(xì)胞系及HT29細(xì)胞系Western Blot分析Fig.10 Western Blot analysis of HCT116 and HT29

a-蛋白條帶；b-GLUT1蛋白灰度值分析；c-HK-Ⅱ蛋白灰度值分析圖11 小鼠結(jié)直腸組織Western Blot分析Fig.11 Western Blot analysis of colorectum tissue in mice

3 討論

葡萄糖含量和脂肪含量高的飲食，即西式飲食，已被證明會誘導(dǎo)腸道發(fā)生多種生理及病理變化，繼而增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險[15]，不僅在發(fā)達(dá)國家，在低收入和中等收入國家，結(jié)直腸癌的發(fā)病率也在迅速上升[16]。葡萄糖的代謝產(chǎn)能為正常細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞提供能量，而腫瘤細(xì)胞有著更強的代謝水平[17]，當(dāng)腫瘤出現(xiàn)異常的葡萄糖代謝時，其自身會發(fā)生DNA修復(fù)異常及自噬改變等多種生理變化，從而引發(fā)腫瘤的增殖、細(xì)胞周期及耐藥性的改變[18-20]。因此，弱化腫瘤糖代謝是癌癥臨床治療中一個重要的思路[21]。

甘露糖與葡萄糖在2號碳位互為差向異構(gòu)體[22]，且兩者有著共同的轉(zhuǎn)運載體蛋白GLUT1。GLUT1是多種組織細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖攝取時的載體蛋白，尤其是它負(fù)責(zé)將葡萄糖運輸?shù)郊t細(xì)胞中，使血糖濃度水平維持在大約5 mmol/L[11]，本研究中所用的低糖(葡萄糖濃度為5.56 mmol/L)DMEM培養(yǎng)基，接近該水平。GLUT1的高表達(dá)與大多數(shù)癌癥患者化療耐藥性及低生存率相關(guān)[12,23]，同時其表達(dá)量也是癌癥患者重要的預(yù)后指標(biāo)[11]。雖然糖酵解是結(jié)直腸癌細(xì)胞的重要代謝途徑，但糖酵解途徑也廣泛存在于正常細(xì)胞，因此，在結(jié)直腸癌細(xì)胞糖酵解通路中特異性高表達(dá)的蛋白應(yīng)作為干擾的重點[24]。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著性提高[25-27]，是其葡萄糖代謝過程中的第一個限速轉(zhuǎn)運蛋白[28]，因此GLUT1是一個理想的干擾靶點。抑制GLUT1的表達(dá)會減弱癌細(xì)胞的增殖[29]，有研究表明，抑制人類口腔鱗狀癌細(xì)胞的GLUT1表達(dá)后，其細(xì)胞活力及增殖能力顯著降低[30]。另一項研究表明，二甲雙胍可以抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480移植瘤小鼠腫瘤的增殖，這與二甲雙胍降低腫瘤細(xì)胞GLUT1表達(dá)有關(guān)[31]。本研究表明，在受到甘露糖影響后，在體外實驗及體內(nèi)實驗水平，結(jié)直腸癌細(xì)胞中的GLUT1表達(dá)均有所下調(diào)，我們認(rèn)為這是一個影響2種受試細(xì)胞系培養(yǎng)液中葡萄糖消耗量降低的重要因素，這也是減弱它們增殖能力的一個重要因素。在腫瘤細(xì)胞中，HK-Ⅱ受其催化產(chǎn)物6-磷酸葡萄糖的反饋抑制，但因腫瘤細(xì)胞快速的代謝流可以使6-磷酸葡萄糖迅速消耗，故對HK-Ⅱ的抑制作用很小[24]，這與我們的實驗結(jié)果相符，因為甘露糖的存在降低了結(jié)直腸癌細(xì)胞中GLUT1的表達(dá)，細(xì)胞的葡萄糖攝取受到抑制，繼而代謝流受到影響，對反饋抑制的最終結(jié)果無影響，因此本研究中，HK-Ⅱ的表達(dá)基本無變化。

4 結(jié)論

本研究表明，一定劑量范圍內(nèi)，甘露糖能夠在體外減弱結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和HT29的增殖，并在此劑量范圍內(nèi)，細(xì)胞毒性作用較??；在AOM/DSS誘導(dǎo)的原發(fā)結(jié)直腸腫瘤小鼠模型中，甘露糖干預(yù)后，小鼠結(jié)直腸腫瘤的個數(shù)顯著性降低(P<0.05)，且腫瘤發(fā)展程度低，健康小鼠給予相同方式的甘露糖干預(yù)，其體征未發(fā)現(xiàn)明顯異常；深入探究發(fā)現(xiàn)，甘露糖能夠降低前述2種結(jié)直腸癌細(xì)胞系葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1的表達(dá)，并能夠降低兩者培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗量，在動物模型中也觀察到GLUT1表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象。因此，我們認(rèn)為在甘露糖的干預(yù)下，結(jié)直腸癌細(xì)胞的葡萄糖攝取因GLUT1下調(diào)而被限制，繼而其發(fā)生及增殖受到影響。本文研究成果對進(jìn)一步探究甘露糖抑制結(jié)直腸癌發(fā)生及增殖提供了一些思路。