袁惠君，高澤，王絹絹，鮑婧婷，馮再平

(蘭州理工大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730050)

寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)是西北半干旱地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)林種，其葉、果實(shí)均可食用和藥用，尤其是其干燥果實(shí)——枸杞子，是一種享譽(yù)國(guó)內(nèi)外的藥食同源滋補(bǔ)佳品[1]。在生產(chǎn)中，枸杞鮮果保質(zhì)期僅2～3 d[2]，必須在短期內(nèi)通過(guò)晾曬或烘干制成干品。但是，寧夏枸杞果實(shí)表皮蠟質(zhì)極發(fā)達(dá)[3]，厚度可超過(guò)0.1 mm，保水性強(qiáng)，成為枸杞果實(shí)干制加工中的主要障礙。

寧夏枸杞果實(shí)表皮蠟質(zhì)主要成分為C29烷烴，占蠟質(zhì)總量的42.9%[3]。目前，對(duì)參與植物表皮蠟質(zhì)烷烴合成代謝中的酶基因及其功能沒(méi)有完全鑒定，僅在擬南芥中取得少量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，醛脫羰基酶(ECERIFERUM1，CER1)催化長(zhǎng)鏈偶數(shù)碳脂肪醛脫羰基，轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)鏈奇數(shù)碳烷烴，影響C29烷烴及其他長(zhǎng)鏈奇數(shù)碳烷烴、醇和酮的合成，是長(zhǎng)鏈烷烴合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，與提高表皮保水性密切相關(guān)[4-5]。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)是指利用基因工程技術(shù)使體內(nèi)合成一些針對(duì)特定基因的短片段單鏈RNA與該基因的mRNA結(jié)合，形成部分雙鏈RNA，促使mRNA降解，從而特異地阻斷該基因在體內(nèi)表達(dá)，獲得該基因缺陷株系的技術(shù)[6-7]。因該技術(shù)具有特異性強(qiáng)[8-9]、效率高[10]、能沉默基因家族和多基因[11]、基因沉默效果可傳代[12]等優(yōu)點(diǎn)，成為近20年來(lái)最重要的鑒定基因功能[13]和選育經(jīng)濟(jì)植物新品種[14-15]的方法之一。

扁果枸杞(Lyciumbarbarumssp. Bianguo)是寧夏枸杞的一個(gè)品種，不僅其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值優(yōu)于其他品種[16]，也是一種表皮蠟質(zhì)極為發(fā)達(dá)的抗旱耐鹽植物[17]。本文以扁果枸杞LbCER1基因?yàn)槟繕?biāo)，構(gòu)建LbCER1-RNAi植物表達(dá)載體，并通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) GV3101中，為進(jìn)一步獲得LbCER1-RNAi沉默株系，鑒定LbCER1基因功能及選育適宜于干制加工的寧夏枸杞品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

含有LbCER1基因開(kāi)放閱讀框的pMD-19質(zhì)粒、pKANNIBAL質(zhì)粒,由本實(shí)驗(yàn)室保存，pART27質(zhì)粒和根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株,由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院王鎖民教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

PCR擴(kuò)增試劑盒、T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、DNA膠回收試劑盒，TAKARA公司；DNA marker，Novoprotein公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶，Thermo Scientific公司；質(zhì)粒提取試劑盒，OMEGE公司；瓊脂糖和引物合成，上海生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；Genesy 96T型PCR擴(kuò)增儀，西安天隆科技有限公司；5424R型高速冷凍離心機(jī): 德國(guó)Eppendorf 公司；Nichipet ExⅡ型移液槍，日本立洋公司；HH-S6型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 以LbCER1為靶標(biāo)的RNAi 中間載體的構(gòu)建

根據(jù)LbCER1基因開(kāi)放閱讀框序列選定1 469～1 840 bp區(qū)段作為RNAi 最佳靶位區(qū)段，該片段長(zhǎng)372 bp，包含3個(gè)最佳RNAi作用位點(diǎn)。根據(jù)該片段序列設(shè)計(jì)引物，上游P1為5′-GGAGAGGACACGCTCGAG-AGCTTACCCCTGAGGCTGCAG(XhoI)，下游P2為5′-TTTCCTTACCAATTGGGGTACCAAAATCCATGATCGA-GACTAGCTTTCC(KpnI)，劃線部分為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好含LbCER1開(kāi)放閱讀框的pMD-19質(zhì)粒為模板，用引物P1、P2通過(guò)PCR法擴(kuò)增選定的靶位區(qū)段，PCR條件為95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；循環(huán)33次，72 ℃終延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物連接到T載體測(cè)序，正確的克隆提取質(zhì)粒后用XhoI/KpnI雙酶切，回收小片段，同 T4連接酶與經(jīng)同種限制性內(nèi)切酶雙酶切并回收大片段的載體pKANNIBAL連接，得到重組克隆pKANNIBAL-LbCER1(+)，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。以P3、P4為引物，進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性菌落。P3序列為5′-AGAAGACGTTCCAACCACG，P4序列為5′-AAAATCCATGATCGAGACTAGCTTTCC。挑取陽(yáng)性菌落測(cè)序驗(yàn)證pKANNIBAL-LbCER1(+)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。

以含LbCER1開(kāi)放閱讀框的pMD-19質(zhì)粒為模板，以P5、P6為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到插入片段的負(fù)向產(chǎn)物。P5序列為5′-TTCGAAATCGATAAGCTTAAAATCCATGATCGAGACTAGCTTTCC-3′(HindⅢ)，P6序列為5′- TTAAAGCAGGACTCTAGAAGCTTACCCCTGAGGCTGCA-G-3′(XbaI)。測(cè)序驗(yàn)證序列正確后，提取質(zhì)粒，用HindⅢ/XbaI雙酶切，回收小片段，再次與經(jīng)HindⅡ/XbaI雙酶切并回收大片段的pKANNIBAL-LbCER1(+)質(zhì)粒連接，得到重組的中間載體pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)，轉(zhuǎn)化至 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。以P7、P8為引物，進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增檢測(cè)陽(yáng)性菌落。P7為5′-CGGTAAGGATCTGAGCTACAC-3′， P8為5′-AAAATCCATGATCGAGACTAGCTT-TCC-3′。挑取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，用XhoI/XbaI雙酶切質(zhì)粒后電泳檢測(cè)pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。

1.3.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

將測(cè)序正確的pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質(zhì)粒用NotI酶切，與經(jīng)同樣酶切回收的pART27 載體用T4連接酶相連，構(gòu)建植物RNAi 表達(dá)載體pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。

用凍融法將pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，陽(yáng)性菌落用引物P3、P4做正向片段菌落 PCR驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 LbCER1基因RNAi 最佳靶位區(qū)段的擴(kuò)增

根據(jù)扁果枸杞LbCER1基因開(kāi)放閱讀框序列設(shè)計(jì)RNAi最佳靶位區(qū)段長(zhǎng)372 bp，加上設(shè)計(jì)引物時(shí)所帶的酶切位點(diǎn)和T載體連接區(qū)域共計(jì)40 bp，PCR產(chǎn)物預(yù)期長(zhǎng)度應(yīng)為412 bp。電泳結(jié)果表明，在250～500 bp有明顯條帶(圖1)，符合預(yù)期結(jié)果。測(cè)序分析也證明該P(yáng)CR產(chǎn)物序列與LbCER1基因相應(yīng)序列相似度為100%。

圖1 LbCER1基因RNAi靶位區(qū)段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR production of LbCER1 gene’s targeted segments for RNA interference注：M-DNA marker(下同); 1～4泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

RNAi載體靶基因序列長(zhǎng)度、位置的選擇都將影響基因沉默的效率和效果。一般認(rèn)為，用于RNAi的基因片段長(zhǎng)度在200～1 000 bp 都能發(fā)揮作用。在植物中，通常構(gòu)建發(fā)卡狀RNA(hairpin RNA，hpRNA)所選靶序列長(zhǎng)98～853 bp可達(dá)到較高的沉默效率，其轉(zhuǎn)化植株沉默效率可達(dá)66%～100%，平均90%[10]。RNAi載體靶基因序列通常以mRNA開(kāi)放閱讀框區(qū)域作為設(shè)計(jì)RNAi的作用靶點(diǎn)，一般在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游100 bp以后[8]。本文選取的RNAi作用靶基因長(zhǎng)372 bp，位于扁果枸杞LbCER1基因開(kāi)放閱讀框序列1 469～1 840 bp區(qū)段，在GenBank中經(jīng)BLAST全基因組掃描及序列同源性分析表明，所選靶序列與其他基因序列沒(méi)有同源性，不會(huì)引起多基因沉默。因此， RNAi載體構(gòu)建設(shè)計(jì)合理，預(yù)期能對(duì)靶基因產(chǎn)生滿意的沉默效果。

2.2 RNAi中間載體的構(gòu)建

以P3、P4為引物，進(jìn)行菌落 PCR檢測(cè)pKANNIBAL-LbCER1(+)質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果，在500～750 bp接近500 bp處有明顯條帶(圖2-a)。由于上游引物P3起始于CaMV 35S啟動(dòng)子的一部分，距離XhoI酶切位點(diǎn)長(zhǎng)141 bp，因此，預(yù)期正向片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)513 bp。電泳結(jié)果符合預(yù)期，測(cè)序結(jié)果與LbCER1基因序列也一致，表明LbCER1正向片段插入正確。

以P7、P8為引物，擴(kuò)增pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質(zhì)粒中LbCER1的負(fù)向片段，由于下游引物P8終止于載體OCS terminator的一段序列，從XbaI酶切位點(diǎn)到引物P8長(zhǎng)115 bp，因此預(yù)期負(fù)向片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)487 bp。電泳結(jié)果顯示，在接近500 bp處有明顯條帶(圖2-b)，符合預(yù)期結(jié)果，表明LbCER1負(fù)向片段插入正確。

XhoI/XbaI雙酶切質(zhì)粒pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質(zhì)粒，電泳后，在5 000～6 000 bp、1 000～2 000 bp分別有明顯的條帶(圖2-c)。由于pKANNIBAL空載質(zhì)粒為6 063 bp，其中包含767 bp的間隔序列——丙酮酸脫氫酶激酶內(nèi)含子序列(PDK intron)，雙酶切后的質(zhì)粒片段去掉PDK intron序列，又保留了兩端各4 bp的酶切位點(diǎn)，因此應(yīng)為5 234 bp，與雙酶切后電泳圖中位于6 000～8 000 bp的條帶相符。根據(jù)pKANNIBAL質(zhì)粒序列分析，正向片段距離PDK intron為8 bp，PDK intron與反向片段之間為21 bp，因此雙酶切后LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)片段預(yù)測(cè)長(zhǎng)度為1 540 bp，也與雙酶切電泳圖中位于1 000～2 000 bp的條帶位置相符，表明pKANNIBAL-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

研究表明，RNAi載體若僅含1段正向序列或其反向序列，則沉默效率僅為10%左右，但是如果載體構(gòu)建成正向序列-間隔序列-列反向序列，形成hpRNA，其沉默效率可達(dá)到50%[18-19]，而具有“正向序列-內(nèi)含子-反向序列”的ihpRNA載體沉默效率可達(dá)到90%～100%[20]。

a-PCR法檢測(cè)LbCER1正向片段插入pKANNIBAL載體；b-PCR法檢測(cè)LbCER1反向片段插入pKANNIBAL載體；c-XhoI/XbaI雙酶切法檢測(cè)載體中的LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)片段圖2 RNAi中間載體的構(gòu)建Fig.2 Construction of RNAi intermediate vector注：圖a、b中1～6、1～10泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖c中1、2泳道為雙酶切產(chǎn)物

2.3 RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建

以P3、P4為引物，用菌落 PCR法檢測(cè)RNAi表達(dá)載體pART27中的LbCER1正向片段，預(yù)期片段長(zhǎng)度應(yīng)為513 bp。電泳結(jié)果表明，在500～750 bp靠近500 bp的位置有明顯條帶(圖3-a)，與預(yù)測(cè)相符，表明pART27中含有LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)序列。進(jìn)一步用XhoI、XbaI雙酶切RNAi表達(dá)載體pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)，預(yù)測(cè)大片段應(yīng)為pART27質(zhì)粒的線性產(chǎn)物，大小為11 660 bp；小片段應(yīng)為L(zhǎng)bCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)，長(zhǎng)度為1 540 bp。電泳檢測(cè)結(jié)果表明，在8 000 bp之上、1 000～2 000 bp分別有2條明顯的條帶(圖3-b)，與預(yù)期結(jié)果符合。上述結(jié)果均表明RNAi表達(dá)載體pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)的構(gòu)建正確。

a-PCR法檢測(cè)載體pART27中的LbCER1正向片段，b-XhoI、XbaI雙酶切法檢測(cè)pART27載體中的LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)片段圖3 PCR法和限制性內(nèi)切酶酶切分析RNAi表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果Fig.3 PCR analysis and restriction enzyme digestion analysis of RNAi expression vector注：圖a中1～10泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖b中1、2泳道為雙酶切產(chǎn)物

2.4 含RNAi表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101的制備

以P3、P4為引物，用菌落 PCR法擴(kuò)增含RNAi表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株中的正向片段，在500～750 bp靠近500 bp的位置有明顯條帶(圖4)，與預(yù)測(cè)的513 bp相符，表明轉(zhuǎn)基因根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株構(gòu)建成功。

RNA干擾技術(shù)也存在不足，例如在快速繁殖的細(xì)胞中，RNAi可能不起作用[21]；RNAi可能引起同源基因的沉默；siRNA和反義RNA都有可能引發(fā)基因沉默[19]，因此當(dāng)表型出現(xiàn)時(shí)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證；沉默效率與dsRNA的長(zhǎng)度之間的關(guān)系不確定，一般是雙鏈RNA的臂越短，沉默效率越低[22-24]。因此，本文構(gòu)建的LbCER1-RNAi轉(zhuǎn)基因根癌農(nóng)桿菌株最終的沉默效果需要通過(guò)檢測(cè)扁果枸杞遺傳轉(zhuǎn)化苗中LbCER1的表達(dá)量和表型等多方面證據(jù)證明。

圖4 PCR法鑒定含RNAi表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌GV3101Fig.4 Identify Agrobacterium tumefaciens GV3101 containing RNAi expression vector by PCR注：1～4泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

3 結(jié)論

本文克隆了扁果枸杞LbCER1基因開(kāi)放閱讀框中1 469～1 840 bp區(qū)段，將其通過(guò)不同的限制性內(nèi)切酶雙酶切組合按正向和反向分別插入pKANNIBAL載體中PDK intron的兩側(cè)，構(gòu)建了具有LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)發(fā)卡狀反向重復(fù)序列的pKANNIBAL載體，并將該反向重復(fù)序列通過(guò)酶切、連接轉(zhuǎn)入RNAi表達(dá)載體pART27，再用凍融法將pART27-LbCER1(+)-PDK intron-LbCER1(-)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101，得到含有LbCER1-RNAi質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌GV3101菌株，為進(jìn)一步鑒定CER1基因在旱生植物表皮蠟質(zhì)烷烴合成過(guò)程中的功能，揭示表皮蠟質(zhì)與植物保水性的關(guān)系，培育適宜干制加工的果蔬新品種奠定基礎(chǔ)。