趙巖巖，王書彥，趙琳琳，趙璐，周威，崔震昆，張浩，王淼焱，王書賢，趙圣明

1(河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)2(新鄉(xiāng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 旅游管理系， 河南 新鄉(xiāng)，453006)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是食品中常見的致病菌。其引起的食物中毒主要癥狀為嘔吐、腹瀉，嚴(yán)重可導(dǎo)致局部或全身感染[1-4]。蠟樣芽孢桿菌可污染谷物類、調(diào)味品、乳制品和肉制品等多種食品[5-6]，在低溫和低pH條件下可以存活[7]，因此低溫保存的食品也會受到蠟樣芽孢桿菌的污染，如蠟樣芽孢桿菌是影響低溫乳制品貨架期的一個主要因素[8-9]。據(jù)統(tǒng)計，2002—2015年發(fā)生在校園的生物污染食源性疾病事件中蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌位居前三位[10]。

我國對食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測主要采用GB4789.14—2014《食品微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽孢桿菌檢驗》進(jìn)行[11-12]。該法周期長，當(dāng)蠟樣芽孢桿菌數(shù)較少時結(jié)果不準(zhǔn)確。目前基于特異性靶點的PCR檢測技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品病原微生物檢測。如基于rpoB[13]和ompA[14]對克羅諾桿菌屬進(jìn)行PCR檢測，基于gene_3105[15]對甲型副傷寒沙門氏菌進(jìn)行PCR檢測以及基于LMOf2365_2721，AX25_00730[16]對單增李斯特菌進(jìn)行PCR檢測等。

目前基于特異性靶點基因?qū)ο灅友挎邨U菌的PCR檢測方法已有較多報道，包括基于gyrB、16S rRNA[17]、pcplc[18]和HBLA[19]等特異性靶點。但是一些靶點的特異性不強(qiáng)，如HBLA在蘇云金芽孢桿菌中也存在。因此為了豐富蠟樣芽孢桿菌的PCR快速檢測方法，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)方法，從蠟樣芽孢桿菌全基因數(shù)據(jù)中篩選特異性基因，以篩選到的特異性基因為靶點設(shè)計特異性引物，建立蠟樣芽孢桿菌的PCR檢測體系，并將其應(yīng)用于牛肉和豬肉實際樣品中，為食品中蠟樣芽孢桿菌的快速檢測提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

牛肉和豬肉樣品，購自河南省新鄉(xiāng)市某農(nóng)貿(mào)市場。菌株信息如表1所示。

表1 菌株及PCR擴(kuò)增結(jié)果Table 1 The bacteria strains used in the PCR specificity test

續(xù)表1

菌株來源gene_953gene_18688gene_2625gene_2626gene_2627gene_2639蠟樣芽孢桿菌kj-9實驗室保藏--++++短小芽孢桿菌CICC63202------凝結(jié)芽孢桿菌CICC20138------巨大芽孢桿菌CICC10448------嗜熱脂肪地芽孢桿菌CICC20139------酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌CICC10374------高地芽孢桿菌CGMCC6075------多粘類芽孢桿菌CGMCC4314-----+地衣芽孢桿菌CGMCC14830------枯草芽孢桿菌ATCC9943------枯草芽孢桿菌G21實驗室保藏------枯草芽孢桿菌nja-9實驗室保藏-----+腸炎沙門氏菌CICC21957------熒光假單胞菌AS1.1802------粘滯沙雷氏菌CICC10187------奇異變形桿菌CMCC49005------鳥腸球菌ATCC14205------藤黃微球菌CMCC28000------阪崎腸桿菌CICC21560------植物乳桿菌CGMCC10686------乳酸乳球菌CICC6242------大腸桿菌ATCC25922------鼠傷寒沙門氏菌CMCC51005------陰溝腸桿菌ATCC13047------金黃色葡萄球菌CMCC26003------單增李斯特菌CICC21662------志賀氏菌CICC21534------蠟樣芽孢桿菌ATCC14579+++++蠟樣芽孢桿菌CMCC63302++-+-蠟樣芽孢桿菌CGMCC4348-+++-蠟樣芽孢桿菌AS1.1846-+++-蠟樣芽孢桿菌kj-9實驗室保藏--++-短小芽孢桿菌CICC63202-----凝結(jié)芽孢桿菌CICC20138-----巨大芽孢桿菌CICC10448-----嗜熱脂肪地芽孢桿菌CICC20139-----酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌CICC10374-----高地芽孢桿菌CGMCC6075+----多粘類芽孢桿菌CGMCC4314-----地衣芽孢桿菌CGMCC14830+----枯草芽孢桿菌ATCC9943---+-枯草芽孢桿菌G21實驗室保藏---+-枯草芽孢桿菌nja-9實驗室保藏---+-腸炎沙門氏菌CICC21957-----熒光假單胞菌AS1.1802-----粘滯沙雷氏菌CICC10187-----奇異變形桿菌CMCC49005-----鳥腸球菌ATCC14205-----藤黃微球菌CMCC28000-----阪崎腸桿菌CICC21560-----植物乳桿菌CGMCC10686-----乳酸乳球菌CICC6242-----大腸桿菌ATCC25922-----鼠傷寒沙門氏菌CMCC51005-----陰溝腸桿菌ATCC13047-----金黃色葡萄球菌CMCC26003-----單增李斯特菌CICC21662-----志賀氏菌CICC21534-----

注：+表示PCR陽性結(jié)果；-表示PCR陰性結(jié)果(下同)

1.1.2 試驗試劑

營養(yǎng)瓊脂(NA培養(yǎng)基)，英國Oxoid公司；Ezup柱式細(xì)菌總DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；引物合成，武漢金開瑞生物工程有限公司；GoldView核酸染料，北京索萊寶科技有限公司；2×Taq Mix、dNTP、6×loading buffer和DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量DL2000 Marker，南京諾維贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5418高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；JS-380C全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀，上海培清科技有限公司；PowPacTM HC164-5052高電流電泳儀，美國Bio-Rad公司；PTC-100TMPCR儀，美國MJ Research公司；NV3000C微量紫外分光光度計儀，北京凱奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 特異性基因的篩選

從NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/genomes/Bacteria/)基因組公共數(shù)據(jù)庫中，獲取蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579的基因組DNA序列。將全基因組DNA序列中的每個基因在NCBI的BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)程序中進(jìn)行比對。選擇Query cover值為100%的同源性最好，同時與其他芽孢菌屬的菌株不具有同源性的基因作為該蠟樣芽孢桿菌的準(zhǔn)特異性基因。

1.3.2 引物設(shè)計

使用Premier 5.0軟件(Premier Biosoft International Inc.，USA)選擇序列長度在400 bp以上的準(zhǔn)特異性基因設(shè)計引物。獲得的引物再通過Oligo 6.0軟件和BLAST網(wǎng)站進(jìn)行分析，選擇與非模板DNA同源性較低的引物作為該基因的特異性引物(表2)。

表2 引物序列及擴(kuò)增片段大小Table 2 Primer sequences and the length of amplification fragments

1.3.3 實驗菌株基因組DNA提取

使用Ezup柱式細(xì)菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.3.4 引物特異性評價

以基因組DNA為模板，采用引物gFA1、gFA2、gFA3分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為2×PCR Taq Master 12.5 μL、上下游引物(0.4 μmol/L)各1 μL、DNA模板1 μL和ddH2O 9.5 μL；總反應(yīng)體25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s以上過程進(jìn)行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，并在凝膠成像儀中觀察電泳結(jié)果。

1.3.5 PCR檢測體系的建立

以蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579的基因組DNA為模板，對PCR檢測體系進(jìn)行優(yōu)化。確定最佳反應(yīng)體系為10×PCR buffer(Mg2+free)3 μL、dNTP 0.5 μmol/L、MgCl24.5 mmol/L、Taq聚合酶0.6 U、引物gFA2 0.8 μmol/L、DNA模板2 μL、ddH2O 4 μL；總反應(yīng)體25 μL。優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；再95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s以上過程進(jìn)行35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3.6 蠟樣芽孢桿菌PCR檢測引物靈敏度評價

通過核酸濃度測定儀測定初始基因組DNA濃度，再利用無菌蒸餾水10倍梯度稀釋。以稀釋后的DNA溶液為模板，利用上述PCR體系及程序進(jìn)行反應(yīng)，確定靈敏度較高的引物對。

1.3.7 PCR檢測體系的抗干擾能力評價

將牛肉和豬肉樣品采用國標(biāo)方法檢測，確定無蠟樣芽孢桿菌污染后，分別取牛肉和豬肉各25 g，分別在LB培養(yǎng)基中增菌12 h獲得各自的背景增菌液，采用平板菌落計數(shù)法測定菌液濃度。同時培養(yǎng)蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579，采用平板菌落計數(shù)法測定菌液初始濃度，使用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。取5 mL 108CFU/g至101CFU/g的蠟樣芽孢桿菌菌液分別與牛肉背景菌群濃度為5.28×107CFU/mL和豬肉背景菌群濃度為7.75×106CFU/mL混合均勻，按照1.3.3提取菌液的總基因組DNA。以混合菌液總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時以無菌水作空白對照。

1.3.8 人工污染實驗

人工污染菌為蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579，接種于LB培養(yǎng)基增菌12 h后，用0.9%無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋。取不同稀釋度的菌液接種于經(jīng)巴氏殺菌(85 ℃處理15 s)的牛肉和豬肉樣品中，每個處理3個重復(fù)。每個樣品取25 g，分別用1 mL不同稀釋度的蠟樣芽孢桿菌菌液污染后，無菌均質(zhì)2 min，置入225 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min增菌培養(yǎng)12 h。在培養(yǎng)過程中從4 h開始每隔2 h取1 mL的增菌液提取DNA，按照1.3.5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時以無菌水作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟樣芽孢桿菌特異性基因驗證

將蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579的基因通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列比對。共獲得11個準(zhǔn)特異性基因分別為gene_953(genebank登錄號BC0954)、gene_1868(genebank登錄號BC1872)、gene_2625(genebank登錄號BC2629)、gene_2626(genebank登錄號BC2630)、gene_2627(genebank登錄號BC2631)、gene_2639(genebank登錄號BC2643)、gene_2643(genebank登錄號BC2647)、gene_4437(genebank登錄號BC4448)、gene_4438(genebank登錄號BC4449)、gene_4439(genebank登錄號BC4450)和gene_4440(genebank登錄號BC4451)。選取以上6個基因為模板，使用Primer 5.0設(shè)計引物。以5株蠟樣芽孢桿菌和26株非蠟樣芽孢桿菌的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR驗證。PCR擴(kuò)增結(jié)果見表1。結(jié)果表明基因gene_2625、gene_2626、gene_2627表現(xiàn)出更好的特異性，被確定為蠟樣芽孢桿菌的特異性基因。

2.2 PCR檢測體系的建立

通過PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物gFA2擴(kuò)增時條帶最明顯且無非特異性條帶產(chǎn)生。因此選取引物gFA2優(yōu)化蠟樣芽孢桿菌的PCR檢測體系。通過優(yōu)化引物的濃度、Mg2+濃度及Taq聚合酶濃度最終確定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件見1.3.5。優(yōu)化的反應(yīng)體系檢測結(jié)果如圖1所示。

泳道1、2、3-Bacillus cereus；M-DL2000 marker圖1 檢測蠟樣芽孢桿菌的PCR反應(yīng)陽性結(jié)果Fig.1 Positive results obtained in the PCR detection of Bacillus cereus

2.3 PCR檢測體系的特異性評價

以表2中所列菌株的基因組DNA為模板，對優(yōu)化的PCR體系進(jìn)行特異性驗證，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，引物gFA1、gFA2、gFA3分別擴(kuò)增出269、750、591 bp的特異性條帶，而非蠟樣芽孢桿菌基因組DNA沒有條帶。

M-DL2000 marker；1-蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579；2-蠟樣芽孢桿菌CMCC 63202；3-蠟樣芽孢桿菌CGMCC 4348；4-蠟樣芽孢桿菌AS 1.1846；5-蠟樣芽孢桿菌；6-短小芽孢桿菌；7-凝結(jié)芽孢桿菌；8-巨大芽孢桿菌；9-嗜熱脂肪地芽孢桿菌；10-酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌；11-高地芽孢桿菌；12-多黏類芽孢桿菌；13-地衣芽孢桿菌；14-枯草芽孢桿菌；15-枯草芽孢桿菌G21；16-枯草芽孢桿菌nja-9；17-腸炎沙門氏菌；18-熒光假單胞菌；19-黏滯沙雷氏菌；20-奇異變形桿菌；21-鳥腸球菌；22-藤黃微球菌；23-阪崎腸桿菌；24-植物乳桿菌；25-乳酸乳球菌；26-大腸桿菌；27-鼠傷寒沙門氏菌；28-陰溝腸桿菌；29-金黃色葡萄球菌；30-單增李斯特菌；31-志賀氏菌a-gFA1；b-gFA2；c-gFA3圖2 三種引物的特異性檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection specificity of used three primers

2.4 蠟樣芽孢桿菌PCR檢測特異性引物的靈敏度評價

蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579基因組DNA質(zhì)量濃度為35.95 ng/μL，用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋，將系列稀釋的DNA作為模板，應(yīng)用引物gFA1、gFA2、gFA3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以確定檢測體系的靈敏度，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明,gFA2靈敏度較高可達(dá)359.5 fg/μL，gene_2625、gene_2627靈敏度可達(dá)3.595 pg/μL。CAWTHOM等[20]的研究報道用于檢測阪崎腸桿菌的特異性引物Eask的最低檢測靈敏度為10 pg/μL，TAO等[21]報道用于檢測單增李斯特菌的Lm8引物的最低靈敏度為430 fg/μL，因此本研究中所篩選的引物具有較高的檢測靈敏度。

泳道1～6-359.5 fg/μL、3.595 pg/μL、35.95 pg/μL、359.5 pg/μL、3.595 ng/μL、35.95 ng/μL的DNA模板；M-DL2000 markera-gFA1;b-gFA2;c-gFA3圖3 三種引物的靈敏度檢測結(jié)果Fig.3 PCR detection sensitivity of used three primers

2.5 蠟樣芽孢桿菌特異性引物的抗干擾能力評價

食品樣品中通常存在多種微生物，而非蠟樣芽孢桿菌菌屬的基因組DNA可能會影響PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確度。因此，本研究對特異性引物的抗干擾能力進(jìn)行了評價。將購自農(nóng)貿(mào)市場的牛肉和豬肉樣品經(jīng)國標(biāo)方法檢測無蠟樣芽孢桿菌污染后，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，牛肉的增菌濃度為5.28×107CFU/mL，豬肉的增菌濃度為7.75×106CFU/mL。將不同稀釋度的蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液分別與牛肉和豬肉樣品增菌液混合后提取總基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果如表3和表4所示。由表3可知，當(dāng)牛肉背景菌液濃度為5.28×107CFU/mL時，蠟樣芽孢桿菌濃度高于3.74×104CFU/mL的樣品可以擴(kuò)增得到gene_2625、gene_2626和gene_2627的條帶。而當(dāng)蠟樣芽孢桿菌濃度為3.74×103CFU/mL時，僅可以擴(kuò)增出gene_2626的條帶，其他2個基因無條帶。說明此時樣品中蠟樣芽孢桿菌濃度較低，牛肉樣品背景菌液濃度較高，對檢測結(jié)果產(chǎn)生了干擾。由表4可知，當(dāng)豬肉背景菌液濃度為7.75×106CFU/mL時，蠟樣芽孢桿菌濃度高于3.74×103CFU/mL的樣品可以擴(kuò)增得到gene_2625、gene_2626和gene_2627的條帶。而當(dāng)蠟樣芽孢桿菌濃度低于3.74×103CFU/mL時，3個目的基因均無擴(kuò)增條帶產(chǎn)生。說明豬肉樣品背景菌液濃度較高，對檢測結(jié)果產(chǎn)生了干擾。本研究中在牛肉背景菌濃度5.28×107CFU/mL和豬肉背景菌濃度7.75×106CFU/mL的干擾下，當(dāng)蠟樣芽孢桿菌的濃度高于3.74×103CFU/mL，均可檢測到目的條帶。說明本研究中蠟樣芽孢桿菌特異性引物具有較強(qiáng)的抗干擾能力。

表3 牛肉微生物菌群對蠟樣芽孢桿菌檢測的干擾Table 3 Effect of pork background flora to detection of Bacillus cereus

表4 豬肉微生物菌群對蠟樣芽孢桿菌檢測的干擾

2.6 蠟樣芽孢桿菌人工污染牛肉和豬肉樣品的檢測

食品樣品中組分較為復(fù)雜，一些成分會影響PCR反應(yīng)，從而影響PCR檢測結(jié)果，因此需要通過檢測人工污染實驗來評價檢測結(jié)果的可靠性[22]。本研究選用牛肉和豬肉作為人工污染對象，牛肉樣品中蠟樣芽孢桿菌的污染濃度分別為4.62×103、4.62×102、4.62×101、4.62 CFU/g。當(dāng)增菌培養(yǎng)10 h后，3對引物檢測各污染濃度結(jié)果均呈陽性。增菌4 h時，只有污染濃度為4.62×103CFU/g的樣品呈陽性，結(jié)果如表5所示。豬肉樣品中蠟樣芽孢桿菌的污染濃度分別為8.38×103、8.38×102、8.38×101、8.38 CFU/g。當(dāng)增菌培養(yǎng)10 h后，3對引物檢測各污染濃度結(jié)果均呈陽性。增菌4 h時，只有污染濃度為8.38×102和8.38×103CFU/g的樣品呈陽性，結(jié)果如表6所示。以上試驗結(jié)果表明，牛肉和豬肉樣品經(jīng)人工污染蠟樣芽孢桿菌增菌培養(yǎng)10 h后，本研究所用的3對引物對蠟樣芽孢桿菌的檢出限能達(dá)到NCFU/g(0

表5 人工污染牛肉樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Table 5 PCR amplification results of Bacillus cereus in artificially contaminated beef samples

表6 人工污染豬肉樣品PCR擴(kuò)增結(jié)果Table 6 PCR amplification results of Bacillus cereus in artificially contaminated pork samples

3 討論

蠟樣芽孢桿菌是食品中常見的條件致病菌，在我國常發(fā)生由蠟樣芽孢桿菌引起的食源性疾病[23-24]。目前分子生物學(xué)檢測方法已成為食品中蠟樣芽孢桿菌檢測的研究熱點，該檢測方法的關(guān)鍵點是篩選獲得特異性檢測靶點[25]。已報道的特異性蠟樣芽孢桿菌基因有16SrDNA、gyrB、motB、tuf和rpoB等[11-12,26-27]，CAAMAO等[28]確定tuf基因是檢測蠟樣芽孢桿菌的特異性基因，還有研究采用蠟樣芽孢桿菌的腸毒素基因如entFM、嘔吐毒素基因如ces、非溶血性毒素nhe等進(jìn)行分子生物學(xué)檢測[29-30]。使用毒力基因作為特異性靶點進(jìn)行檢測存在一些問題，有些菌株可能不含有該毒力基因，造成出現(xiàn)假陰性檢測結(jié)果；一些毒力基因如nhe和hbl[31]在蘇云金芽孢桿菌中也存在，因此也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本研究試圖尋找更有效的新型特異性檢測靶點基因。利用比較基因組學(xué)的方法，篩選獲得蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579中的特異性基因，設(shè)計的引物經(jīng)PCR驗證，具有良好的特異性和較強(qiáng)的抗干擾能力，人工污染實驗結(jié)果表明，牛肉和豬肉樣品經(jīng)人工污染蠟樣芽孢桿菌增菌培養(yǎng)10 h后，均可以有效檢測出蠟樣芽孢桿菌。同時本研究中建立的檢測方法可在12 h內(nèi)完成對蠟樣芽孢桿菌的檢測。因此本研究建立的檢測方法具有檢測時間短、靈敏度高等優(yōu)點，更適合大量食品樣品的快速檢測。

4 結(jié)論

本研究利用比較基因組學(xué)方法，以蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579基因組序列為模板，篩選得到11個特異性基因，設(shè)計引物進(jìn)行PCR驗證后最終確定基因gene_2625、gene_2626、gene_2627對蠟樣芽孢桿菌的特異性較好，確定其相應(yīng)引物的檢測靈敏度分別為3.595 pg/μL、359.5 fg/μL和3.595 pg/μL。在牛肉和豬肉背景菌群的干擾下，蠟樣芽孢桿菌的檢出限為3.74×103CFU/mL。經(jīng)增菌培養(yǎng)10 h后，本研究所用的3對引物對人工污染的牛肉和豬肉樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出限分別達(dá)到4.62和8.38 CFU/g。