高偉偉，李 莉，樊 華，楊 昊，柳田田，王 囡，朱德發(fā)

橋本甲狀腺炎屬于自身免疫性疾病之一，主要發(fā)生于女性人群[1]。研究[2]顯示，不孕女性具有較高的橋本甲狀腺炎發(fā)生率。因此，對(duì)橋本甲狀腺炎與女性妊娠的關(guān)系進(jìn)行深入研究尤為重要。人及哺乳動(dòng)物的子宮內(nèi)膜經(jīng)過(guò)短暫的“著床窗口期”才允許胚胎著床，這一過(guò)程受到各種信號(hào)物質(zhì)、細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。半乳糖凝集素家族成員在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)以及腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等一系列生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]。既往，半乳糖凝集素-1(galactose agglutinin-1, galectin-1)在腫瘤疾病的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移等方面的相關(guān)研究較多，由于胚胎著床和腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為存在高度相似，因此近年來(lái)galectin-1于生殖領(lǐng)域中的相關(guān)研究日益增多。有研究[4]報(bào)道，galectin-1與妊娠的維持和成功存在一定相關(guān)性，被認(rèn)為可能是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志物之一。鑒于此，現(xiàn)通過(guò)研究子宮內(nèi)膜厚度的改變及galectin-1、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-17a(interleukin-17a，IL-17a)含量關(guān)系，為臨床研究橋本甲狀腺炎和不孕的關(guān)系提供線索，同時(shí)為橋本甲狀腺炎患者不孕癥的治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取8～9周齡的清潔級(jí)健康NOD雌性小鼠共40只，體質(zhì)量20～23 g,均購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)病理科實(shí)驗(yàn)室。所有小鼠均予以自然晝夜節(jié)律光照，控制室內(nèi)溫度20～24 ℃、濕度40%～60%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。小鼠實(shí)驗(yàn)方式嚴(yán)格遵守倫理學(xué)原則，且與安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理相關(guān)條例相符。

1.2 研究方法

1.2.1橋本甲狀腺炎造模 40只小鼠隨機(jī)均分為2組，經(jīng)7 d適應(yīng)性飼養(yǎng)后，取25 μg的豬甲狀腺球蛋白加入100 μl的PBS溶液中混勻，按照1 ∶ 1的比例取弗氏完全佐劑與豬甲狀腺球蛋白溶液混合在研缽之內(nèi)，并于冰浴上研磨，直至其呈“油包水”狀。固定小鼠，采用一次性注射器抽取已制備好的乳狀劑于尾根部行皮下注射，注射劑量為0.1 ml。14 d后按照1 ∶ 1的比例將弗氏不完全佐劑和豬甲狀腺球蛋白混合制成乳化液，隨后按照上述方式進(jìn)行操作。對(duì)照組小鼠注射等量不含有豬甲狀腺球蛋白的弗氏完全佐劑進(jìn)行干預(yù)。造模成功與否由病理實(shí)驗(yàn)室工作人員進(jìn)行判定，成功模型的主要表現(xiàn)為甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)發(fā)生較為嚴(yán)重的破壞，且淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)比較明顯。

1.2.2動(dòng)情周期確定 主要分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期，周期為4～5 d，在小鼠造模周期結(jié)束后1周內(nèi)進(jìn)行小鼠陰道脫落細(xì)胞瑞士染色涂片，在確定動(dòng)情周期后立即取靜脈血，以頸椎脫臼法處死小鼠。

1.2.3標(biāo)本制備 迅速取出小鼠的完整“Y”形子宮，并從子宮分叉處剪斷。將左半子宮放置于4%的多聚甲醛中固定24 h，行石蠟包埋，作矢斷面連續(xù)切片，片厚5 μm，用于HE以及免疫組化染色。另一側(cè)子宮以4%的多聚甲醛固定，用于組織勻漿待行細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.2.4血清抗甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody，TgAb)、甲狀腺抗過(guò)氧化物酶抗體(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine，T4)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平檢測(cè) 確定動(dòng)情周期后的小鼠進(jìn)行乙醚吸入法麻醉處理，隨后打開(kāi)腹腔將下腔靜脈充分暴露，進(jìn)行下腔靜脈采血。以3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存在4 ℃的冰箱中待檢。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清T3、T4、TgAb、TPOAb，ELISA法檢測(cè)血清TSH，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5染色 ① HE染色：小鼠子宮予以脫蠟、復(fù)水處理，以蘇木精染色20 min，隨后予以脫水處理，并于透明后烘干封片，采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖片的拍攝。② 免疫組織化學(xué)染色：取小鼠子宮蠟片進(jìn)行脫蠟、水化、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶操作，并以檸檬酸鹽微波爐加熱暴露抗原決定簇，以山羊血清封閉。上述各項(xiàng)操作結(jié)束后均采用PBS重復(fù)3次洗滌，3 min/次。加入galectin-1抗體(1 ∶ 50)于室溫下孵育1 h后轉(zhuǎn)移至4 ℃條件下孵育過(guò)夜，采用PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。隨機(jī)選取每張切片高倍鏡下5個(gè)視野，采用IPP6.0圖像分析軟件進(jìn)行免疫反應(yīng)產(chǎn)物觀密度值的分析，取平均吸光度(average optical density,AOD)值。

1.2.6mRNA獲取 采用TRIzol試劑盒提取總RNA，并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后以PCR擴(kuò)增技術(shù)獲取mRNA，其中PCR反應(yīng)體系20 μl，包括5 μl 2×SYBR Green mixture，正向(10 μmol/L)與反向引物(10 μmol/L)各1 μl，cDNA 1 μl，核糖核酸酶游離水 2 μl，總RNA 10 μl。反應(yīng)條件如下：95 ℃、2 min，95 ℃、5 s，60 ℃、10 s，共40個(gè)循環(huán)。其中g(shù)alectin-1正向引物為GCCTCCATGTGTTCTTGGTC，反向引物為CTCACCCTCTGTGGTCACTT。

1.2.7采用流式微球捕獲技術(shù)(CBA) 以CBA 人Th1/Th2/Th17細(xì)胞因子試劑盒檢測(cè)組織勻漿TNF-α、IL-17a水平。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2.8觀察指標(biāo) 分別比較2組小鼠血清TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH水平，HE染色鏡下拍照，多功能圖像分析儀測(cè)量動(dòng)情期的子宮內(nèi)膜厚度水平，動(dòng)情期、動(dòng)情前期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期galectin-1 mRNA表達(dá)情況，組織勻漿TNF-α、IL-17a水平。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠血清TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH水平對(duì)比觀察組小鼠血清TgAb、TPOAb水平相比對(duì)照組較高(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 兩組小鼠動(dòng)情周期的子宮內(nèi)膜厚度水平對(duì)比觀察組小鼠動(dòng)情期子宮內(nèi)膜厚度相比對(duì)照組更厚(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

2.3 兩組小鼠動(dòng)情周期galectin-1 mRNA表達(dá)情況對(duì)比觀察組小鼠動(dòng)情各期galectin-1 mRNA表達(dá)水平相比對(duì)照組降低(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.4 兩組小鼠動(dòng)情周期galectin-1 蛋白的AOD對(duì)比觀察組動(dòng)情期和動(dòng)情后期的galectin-1 蛋白的AOD值均較對(duì)照組更低(P<0.05)，而在動(dòng)情前期和動(dòng)情間期的AOD值與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 兩組小鼠組織勻漿TNF-α、IL-17a水平對(duì)比觀察組小鼠組織勻漿TNF-α、IL-17a水平相比對(duì)照組較低(均P<0.05)。見(jiàn)表5。

表1 2組小鼠TgAb、TPOAb、T3、T4、TSH、水平

與對(duì)照組比較：*P<0.05

表2 兩組小鼠動(dòng)情期的子宮內(nèi)膜厚度水平對(duì)比

與對(duì)照組比較：*P<0.05

表3 兩組小鼠動(dòng)情周期galectin-1 mRNA表達(dá)情況對(duì)比

與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖1 2組小鼠子宮內(nèi)膜動(dòng)情周期 HE×100

表4 兩組小鼠動(dòng)情周期galectin-1蛋白的AOD對(duì)比

組別動(dòng)情期(n=8)動(dòng)情前期(n=4)動(dòng)情后期(n=4)動(dòng)情間期(n=4)觀察0.165 7±0.002 9?0.083 1±0.002 50.081 4±0.002 1?0.042 8±0.002 7對(duì)照0.201 8±0.003 60.082 9±0.002 30.139 7±0.002 00.043 3±0.002 6t值22.0880.11840.2070.267P值<0.0010.910<0.0010.799

與對(duì)照組比較：*P<0.05

表5 兩組小鼠組織勻漿TNF-α、IL-17a水平對(duì)比

與對(duì)照組比較:*P<0.05

3 討論

近年來(lái)的研究[5]發(fā)現(xiàn)不孕癥女性合并橋本甲狀腺炎的幾率高于生育能力正常的女性，這提示了橋本甲狀腺炎與不孕癥存在密切相關(guān)。本文采用豬甲狀腺球蛋白于尾根部行皮下注射，建立橋本甲狀腺炎模型。病理下觀察甲狀腺組織濾泡結(jié)構(gòu)發(fā)生較為嚴(yán)重的破壞，且淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)比較明顯，觀察組小鼠血清TgAb、TPOAb水平相比對(duì)照組較高，這與既往研究[6]報(bào)道一致，提示造模成功。小鼠動(dòng)情期相當(dāng)于女性月經(jīng)周期的分泌期，為了有利于胚胎的順利植入及著床，動(dòng)情期的子宮內(nèi)膜較其他3期明顯增厚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)陰道涂片染色確定動(dòng)情周期，結(jié)果表明觀察組小鼠存在動(dòng)情周期，且節(jié)律與對(duì)照組無(wú)差異，提示動(dòng)情周期的節(jié)律未受其疾病影響而改變。HE染色光鏡下觀察顯示觀察組鼠動(dòng)情期子宮內(nèi)膜較同期對(duì)照組增厚、內(nèi)膜腺體增大、數(shù)量增多。推測(cè)機(jī)體免疫改變、炎性反應(yīng)累及子宮內(nèi)膜。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示觀察組小鼠galectin-1 mRNA水平低于對(duì)照組。同時(shí)，觀察組小鼠的galectin-1 蛋白的AOD值在動(dòng)情周期出現(xiàn)了異常表達(dá)，動(dòng)情期低于對(duì)照組。galectin-1主要表達(dá)在滋養(yǎng)細(xì)胞中，屬于母胎間相互作用的重要蛋白質(zhì)之一。其在胎盤(pán)植入、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，可通過(guò)誘導(dǎo)子宮免疫耐受性樹(shù)突細(xì)胞的擴(kuò)張，對(duì)母胎界面的Th1/Th2免疫平衡產(chǎn)生影響，促進(jìn)免疫耐受[7-8]。動(dòng)情期作為妊娠過(guò)程關(guān)鍵時(shí)期，推測(cè)galectin-1 蛋白低表達(dá)可能減弱了細(xì)胞間識(shí)別黏附能力，以及增強(qiáng)誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，促使免疫失衡，不利于妊娠的順利進(jìn)行[9-10]。

本研究選取2組小鼠右半側(cè)子宮組織勻漿進(jìn)行TNF-α、IL-17a水平測(cè)定，結(jié)果顯示觀察組小鼠TNF-α、IL-17a水平相比對(duì)照組均較低，提示存在免疫反應(yīng)異常。TNF-α是一種由活化的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，除具有抗腫瘤作用外，還能夠激活T細(xì)胞、促進(jìn)IL-21、IL-22等細(xì)胞因子的產(chǎn)生與分泌，促進(jìn)炎癥及免疫反應(yīng)。其中Aikawa et al[11]的研究表明，TNF-α已經(jīng)參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、多發(fā)性硬化癥等自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程中。IL-17a是IL-17家族中的重要成員，其可通過(guò)募集中性粒細(xì)胞、刺激巨噬細(xì)胞等多種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并與TNF-α具有協(xié)同作用，加強(qiáng)致炎效應(yīng)，目前已被證實(shí)[12]在RA等自身免疫性疾病中高表達(dá)，若敲除小鼠IL-17基因后，其自身免疫受到抑制。本研究對(duì)于TNF-α、IL-17a水平下降的原因，推測(cè)可能與galectin-1表達(dá)水平的下降有關(guān)。研究[13]表明，galectin-1可以抑制活化T細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡，抑制促炎性細(xì)胞因子的分泌并抵抗炎癥反應(yīng)。另有報(bào)道[14]顯示，galectin-1的敲除可減弱對(duì)TNF-α的促增殖作用的抑制。上述提示了本實(shí)驗(yàn)中g(shù)alectin-1蛋白可能通過(guò)影響TNF-α、IL-17a兩種細(xì)胞因子的分泌來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并維持妊娠。

綜上所述，橋本甲狀腺炎小鼠動(dòng)情期子宮內(nèi)膜厚度增加，動(dòng)情期子宮內(nèi)膜galectin-1水平較對(duì)照組降低，且存在局部免疫反應(yīng)，從而可能導(dǎo)致子宮內(nèi)微環(huán)境改變，對(duì)懷孕產(chǎn)生影響。