張茹君 夏海林 朱赟 黃晶 孟雨菡

[摘要] 目的 通過 CRISPR/Cas9獲得UOX基因敲除的小鼠純合品系，為建立高尿酸血小鼠動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。方法根據(jù)小鼠 UOX 基因第三外顯子前后兩個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)雙sgRNA，通過PCR、體外轉(zhuǎn)錄和純化獲得sgRNA和Cas9 mRNA。將sgRNA和Cas9 mRNA顯微注射進(jìn)小鼠原核胚后，體外培養(yǎng)至二細(xì)胞胚階段，進(jìn)行胚胎移植至代孕母鼠。F0代小鼠出生后，提取其DNA進(jìn)行電泳分析和測序分析。F0代交配繁殖至F2代獲得UOX缺失的小鼠純合品系。 結(jié)果 顯微注射sgRNA和Cas mRNA至原核胚，成功獲得50枚囊胚。移植后生育17只幼鼠。其中，有 8只小鼠UOX基因缺失突變，突變率為47.06 %。成功構(gòu)建了UOX缺失的小鼠純合品系。 結(jié)論 利用 CRISPR/Cas9，成功獲得 UOX缺失的小鼠胚胎和純合品系，為CRISPR/Cas9獲得高尿酸血的小鼠動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] CRISPR/Cas9;UOX;基因編輯;高尿酸;動(dòng)物模型

[中圖分類號] R4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2020）03（a）-0032-04

Construction of Mouse UOX Gene Knockout Model Based on CRISPR / Cas9

ZHANG Ru-jun1， XIA Hai-lin1， ZHU Yun2， HUANG Jing3， MENG Yu-han2

1.Changzhou Cavens Experimental Animal Co.， Ltd.， Changzhou， Jiangsu Province， 213104 China;2.Jiangsu Kebiao Medical Testing Co.， Ltd.， Changzhou，Jiangsu Province， 213461 China;3.Baige Gene Technology （Jiangsu） Co.， Ltd.，Chang zhou， Jiangsu Province， 213000 China

[Abstract] Objective To obtain homozygous strains of UOX knockout mice by CRISPR / Cas9， and to lay the foundation for establishing an animal model of hyperuricemia mice. Methods Double sgRNA was designed based on two sites before and after the third exon of mouse UOX gene， and sgRNA and Cas9 mRNA were obtained by PCR， in vitro transcription and purification. After microinjection of sgRNA and Cas9 mRNA into mouse prokaryotic embryos， they were cultured in vitro to the two-cell embryo stage， and embryos were transferred to surrogate mother rats. After F0 mice were born， their DNA was extracted for electrophoretic analysis and sequencing analysis. FOX generations were bred to F2 generations to obtain UOX-deficient mouse homozygous lines. Results Microinjection of sgRNA and Cas mRNA into prokaryotic embryos successfully obtained 50 blastocysts. After transplantation， 17 young rats were born. Among them， 8 mice had UOX gene deletion mutations， and the mutation rate was 47.06%. A homozygous mouse line lacking UOX was successfully constructed. Conclusion UCRISPR-deficient mouse embryos and homozygous strains were successfully obtained using CRISPR / Cas9， laying a foundation for CRISPR / Cas9 to obtain hyperuricemia mouse animal models.

[Key words] CRISPR / Cas9; UOX; Gene editing; Hyperuricemia; Animal model

高尿酸血癥（hyperuricemia）是由嘌呤代謝紊亂，尿酸排泄障礙引起的血尿酸異常為臨床表現(xiàn)的異質(zhì)性疾病。尿酸病理性升高有5%～12%的風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致尿酸結(jié)晶累積并損傷關(guān)節(jié)[1]，引起痛風(fēng)、急性及慢性關(guān)節(jié)炎等。并且，高尿酸血癥易引發(fā)并發(fā)癥，如高血壓、高血脂、2型糖尿病、冠心病。臨床上常規(guī)的高尿酸血癥及痛風(fēng)治療手段為口服降尿酸藥物[2]，目前尚未有根治痛風(fēng)的藥物，新型降尿酸藥物開發(fā)需要利用高尿酸動(dòng)物模型進(jìn)行降尿酸藥物藥效及藥理篩選。故建立穩(wěn)定性好，更接近患者發(fā)病特征的高尿酸動(dòng)物模型，能提高新型降尿酸藥物開發(fā)效率及成藥性，優(yōu)化痛風(fēng)治療格局。近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)憑借其簡便性、特異性和高效性，在疾病動(dòng)物模型構(gòu)建領(lǐng)域應(yīng)用日趨廣泛和深入。該研究利用CRISPR/Cas9，敲除小鼠基因組內(nèi)尿酸氧化酶（Urate Oxidase，UOX）基因，以誘導(dǎo)小鼠尿酸分解障礙，為建立高尿酸血小鼠動(dòng)物模型奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1? 材料與設(shè)備

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為野生型C57BL/6健康雌鼠（SPF 級，3～4周齡）;野生型雄性C57BL/6健康小鼠（SPF 級，6～8 周齡，體重 30 ～ 35 g），均來自并飼養(yǎng)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK（蘇）2016-0010】。飼養(yǎng)環(huán)境 SPF 級環(huán)境，12 h 交替晝夜，溫度（22±4）℃，濕度（55±10）%。適應(yīng)飼養(yǎng)時(shí)間1周。試驗(yàn)方案通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)審查。

1.2? 實(shí)驗(yàn)試劑

px330-Cas9、px330-sgRNA來自Addgene公司。QIAQuick PCR purification kit來自Qiagen公司。TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit來自Thermo公司（型號：K0441）。TA Cloning kit 來自Invitrogen。水（Nuclease-free）、MEGAshortscript T7 kit、mMESSAG EmMACHINE T7 kit和MEGAclear kit來自Life Technologies公司。β-巰基乙醇、DMSO 、人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）、血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）。

1.3? 實(shí)驗(yàn)儀器

倒置顯微鏡（Olympus，型號：IX73號）;顯微操作裝置（Narishige，型號：MMO-202ND）;電壓沖擊驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（Primer Tech，型號：PMM-150FU）;二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，型號：BB15）;SZX7立體顯微鏡（Olympus，型號：SZX7）。

2? 方法

2.1? 引物設(shè)計(jì)

在Uox基因（NCBI Gene ID ：22262）第三號外顯子功能域的前部和后部分別設(shè)計(jì)兩條sgRNA，根據(jù)sgRNA結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)PCR上游引物 Uox-sgRNA-1、Uox-sgRNA-2，下游引物T7SG-R0。引物序列見表1。

2.2? 制備sgRNA轉(zhuǎn)錄模板

分別按表2混合以下試劑，進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增sgRNA模板。反應(yīng)條件均為98 ℃預(yù)變性 5 min;按循環(huán)程序（98 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 5 min。反應(yīng)產(chǎn)物取 50 μL 進(jìn)行 2 %瓊脂糖凝膠電泳，判斷PCR 結(jié)果。回收DNA。

2.3? sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄

按表3混合sgRNA體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。混勻后，37℃孵育2 h。加DNase 1 μL，37℃孵育15 min;純化，分裝，-80℃保存。

2.4? Cas9 mRNA的體外轉(zhuǎn)錄

按表4混合Cas9 mRNA PCR反應(yīng)體系。正向引物序列為5`-TTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC-3`，反向引物序列為5`-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3`?；靹蚝?，反應(yīng)條件同2.2，反應(yīng)產(chǎn)物取 50 μL 進(jìn)行 2 %瓊脂糖凝膠電泳，判斷PCR結(jié)果?；厥誅NA。

用QIAQuick PCR purification kit純化膠內(nèi)Cas9 PCR產(chǎn)物，用mMESSAGEmMACHINE T7 kit試劑盒體外轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA。用MEGAclear kit純化Cas9 mRNA。

2.5? UOX突變小鼠胚胎的獲得

向若干只雌性C57BL/6小鼠注射5 IU PMSG，48 h后注射10 IU hCG，與雄性C57BL/6小鼠合籠一夜。hCG注射后約20 h，對見栓雌鼠實(shí)施安樂死收集卵丘細(xì)胞復(fù)合體。

將卵丘細(xì)胞復(fù)合體移入M2+透明質(zhì)酸酶培養(yǎng)基中洗滌數(shù)次，胚胎置于37℃的KSOM培養(yǎng)基（用礦物油覆蓋）5%CO2培養(yǎng)。在顯微鏡下用顯微注射針向原核胚內(nèi)注射Cas9 mRNA（100 ng/μL）和UOX-sgRNA（50 ng/μL），繼續(xù)培養(yǎng)胚胎24 h至兩細(xì)胞胚。

2.6? 胚胎移植

結(jié)扎雄鼠與發(fā)情的C57BL/6雌鼠合籠，次日選擇見栓0.5 d的雌鼠作為代孕母鼠。在體視顯微鏡下，從代孕母鼠背部找到輸卵管，將胚胎移從輸卵管移植入子宮。代孕母鼠手術(shù)縫合，放入培養(yǎng)間培養(yǎng)觀察。

2.7? UOX—小鼠鑒定

代孕母鼠3周后生產(chǎn)F0代小鼠。出生后3周雄性和雌性F0代小鼠分開飼養(yǎng)。取出生后3周F0代小鼠尾尖血，用DNeasy blood and tissue kit 提取基因組DNA，PCR驗(yàn)證基因敲除情況，驗(yàn)證序列見表5，PCR擴(kuò)增體系見表6。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性 5 min;按循環(huán)程序（ 95℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 40 s）進(jìn)行30個(gè)循環(huán);68 ℃延伸 5 min。用QIAQuick PCR purification kit 純化PCR產(chǎn)物，用TA Cloning kit 克隆，反應(yīng)產(chǎn)物測序。

2.8? UOX—小鼠純合品系構(gòu)建

將 F0 代的基因敲除小鼠與野生型小鼠交配獲得后代F1，對F1 代小鼠進(jìn)行突變分析。選擇突變的 F1 代雜合雌鼠和雄鼠交配獲得后代F2，對F2 代小鼠進(jìn)行突變分析。對F2代中純合小鼠進(jìn)行交配，以構(gòu)建UOX—小鼠品系

3? 結(jié)果

3.1? F0代小鼠的獲得

該研究兩細(xì)胞胚率為81.7%（58/71），顯微注射了Cas9 蛋白和UOX-sgRNA的胚胎移植至58個(gè)兩細(xì)胞胚。將50個(gè)囊胚移植到2只代孕母鼠子宮，2只均懷孕，共生產(chǎn)17 只小鼠，出生率為34.0%（17/50）。F0代小鼠外觀正常，健康狀態(tài)良好，均無外傷或感染發(fā)生。

3.2? UOX—小鼠鑒定結(jié)果

sgRNA轉(zhuǎn)錄模板經(jīng)擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶消失（圖1），F(xiàn)0代小鼠鼠尾DNA測序結(jié)果顯示，其中8只小鼠的 UOX基因被敲除，突變率為47.06%。突變小鼠的測序圖見圖2。8只UOX—小鼠與未突變小鼠外觀無差異。

4? 討論

高尿酸血癥約80%源于內(nèi)源性尿酸代謝紊亂[3]。高尿酸血癥患者體內(nèi)嘌呤單鈉尿酸鹽（purine monosodium urate，MSU）在關(guān)節(jié)異常累積，會(huì)引起痛風(fēng)。痛風(fēng)嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量，會(huì)導(dǎo)致痛風(fēng)石沉積、關(guān)節(jié)炎反復(fù)發(fā)作和關(guān)節(jié)畸變[4]。據(jù)報(bào)道，中國成年人群痛風(fēng)的校正患病率達(dá) 8.4%[5]。2017年中國痛風(fēng)患者從2009年的9000萬人增長至2017年的1.8億人。并且，痛風(fēng)可加重腎臟病變，增加高脂血癥、高血壓病的發(fā)病率[6-7]。故痛風(fēng)嚴(yán)重影響中國社會(huì)發(fā)展，研究高尿酸血癥和痛風(fēng)的治療藥物及其藥物篩選的動(dòng)物模型，具有顯著的臨床意義及社會(huì)價(jià)值。

利用基因組靶向編輯技術(shù)制備動(dòng)物模型是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)及前沿領(lǐng)域。CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有定位靶向基因組的高效率，轉(zhuǎn)染多個(gè)sgRNA的高成功率的優(yōu)勢，成為廣泛使用的基因編輯技術(shù)之一，已應(yīng)用于構(gòu)建各種疾病的動(dòng)物模型，如神經(jīng)退行性疾病[9]，腫瘤[10]等。CRISPR-Cas系統(tǒng)源于大腸桿菌獲得性免疫系統(tǒng)，主要部件為RNA引導(dǎo)的有規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列sgRNA[11]。通過sgRNA序列，能將Cas9酶切蛋白引導(dǎo)至目的基因特定位點(diǎn)使之DNA 雙鏈斷裂（double-strand breaks，DSB）。非同源性末端接合（Non-homologous end joining，NHEJ）參與修復(fù)DSB，產(chǎn)生突變等位基因。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)基因敲入、重排、激活、抑制、重組和敲除，具有高效、專一和成熟等優(yōu)點(diǎn)。故該研究采用CRISPR/Cas9敲除小鼠體內(nèi)的UOX基因，以構(gòu)建高尿酸血?jiǎng)游锬Ｐ汀?/p>

UOX作為目的基因的考量在于，UOX基因能表達(dá)活化態(tài)UOX蛋白，使小鼠體內(nèi)尿酸在UOX催化下分解為尿囊素，最終形成尿囊酸排泄。若成功基因敲除小鼠UOX基因，有望使尿酸潴留形成高尿酸模型[12]。人體內(nèi)UOX基因在進(jìn)化過程中突變沉默，尿酸無法繼續(xù)分解，成為嘌呤核苷酸代謝終末產(chǎn)物直接排泄[13]。故采用基因敲除小鼠UOX基因的方式改造高尿酸模型，與直接注入誘導(dǎo)劑至動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建的高尿酸模型相比，更真實(shí)復(fù)制人嘌呤代謝紊亂引起的高尿酸血癥及痛風(fēng)機(jī)制。

該研究在小鼠UOX基因第三個(gè)外顯子功能域上設(shè)計(jì)拼接了sgRNA。注射受精卵是獲得CRISPR/Cas9改造動(dòng)物模型最快的途徑[14]，故該研究將體外轉(zhuǎn)錄后的sgRNA和Cas注射到原核胚中。基因編輯后的原核胚體外培養(yǎng)為二細(xì)胞胚，再通過手術(shù)將胚移植到代孕母鼠的子宮內(nèi)孕育。3周后，17只F0代小鼠出生，經(jīng)提取DNA擴(kuò)增后電泳分析和測序分析，其中8只小鼠確定為UOX-突變小鼠，突變率為47.06%，其中一只小鼠為疑似突變。并且，該研究成功繁育成功建立了UOX-突變小鼠純合種群，形成了穩(wěn)定的UOX敲除小鼠模型。突變小鼠與正常小鼠外觀和精神狀態(tài)一致，無感染或外傷發(fā)生。Hosoyamada M等人[12] 雙敲除小鼠Urat1-Uox基因構(gòu)建腎性低血糖癥動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)Urat1-Uox-DKO小鼠中尿酸鹽的尿排泄量比人類高約25倍，印證了該文敲除小鼠UOX基因可用于構(gòu)建高尿酸模型。

綜上所述，該研究首次采用敲除小鼠UOX基因構(gòu)建高尿酸模型，能獲得穩(wěn)定、健康的UOX敲除小鼠品系，為高尿酸動(dòng)物模型的建立提供了新的思路及方法。該研究進(jìn)一步挖掘UOX基因的作用及改造方法，為其科研或臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

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（收稿日期：2019-12-05）