關(guān)水清，周改蓮,2,*，董婧婧，林青華，黃 盼，王 倩

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275；3.康美藥業(yè)股份有限公司，廣東 深圳 518049)

廣地龍為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier ) 的干燥體，其味咸，性寒，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿的功效[1-2]，臨床常用于治療高熱神昏、肢體麻木、半身不遂、高血壓等疾病[3-5]。廣地龍因個(gè)大、質(zhì)佳成為地龍藥材市場(chǎng)的主流產(chǎn)品，主要產(chǎn)自廣東、廣西，為嶺南地區(qū)道地藥材[6-7]。目前藥材市場(chǎng)流通的地龍來(lái)源混亂，摻雜使假現(xiàn)象嚴(yán)重[8-10]，且現(xiàn)行的2015版《中國(guó)藥典》中地龍項(xiàng)下只有顯微鑒別和薄層鑒別，對(duì)其指標(biāo)成分沒(méi)有明確規(guī)定，缺乏定量的評(píng)價(jià)方法[1]。為確保其安全有效地應(yīng)用，根據(jù)國(guó)家對(duì)中藥材及中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化的要求及市場(chǎng)對(duì)廣地龍藥材需求量的增加,故有必要對(duì)廣地龍藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

現(xiàn)代研究表明[11-13]，廣地龍含有蛋白質(zhì)、多肽、核苷酸、氨基酸以及脂肪酸等多種化學(xué)成分，其中以次黃嘌呤為代表的核苷類成分，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗缺血性損傷、抗菌、抗血小板聚集等多種生物活性[14-15]，其與廣地龍舒張支氣管、抗組胺、平喘、調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)血糖、抗缺血性損傷等藥理活性[16-18]具有一定的關(guān)聯(lián)性，可作為廣地龍藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)。為此，本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定廣地龍中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷5種核苷類成分的含量，以期為全面客觀地評(píng)價(jià)廣地龍藥材的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)；Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)(北京迪馬科技有限公司)；SQP型電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)；KQ5200B型超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 藥材與試劑

廣地龍藥材分別于2018年采購(gòu)于廣東、廣西，經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院馬志國(guó)副教授鑒定為鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretimaaspergillum(E. Perrier )的干燥體。藥材低溫干燥后粉碎成粗粉，過(guò)60目(相當(dāng)于孔徑250 μm)篩，備用。具體見表1。

尿嘧啶(批號(hào):wkq18013109，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于等于98%)、次黃嘌呤(批號(hào):wkq16091402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于等于98%)、尿苷(批號(hào):wkq17100902，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于等于98%)、肌苷(批號(hào):wkq17111309，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于等于98%)、鳥苷(批號(hào):wkq17092012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于等于98%)均購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司；甲醇(色譜純，F(xiàn)esher公司)；水為自制純化水；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(5∶95，體積比)等度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量:10 μL。按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，廣地龍中各成分分離度良好，對(duì)照品和供試品色譜圖見圖1、2。

表1 20批廣地龍樣品來(lái)源信息

1. 尿嘧啶， 2. 次黃嘌呤， 3. 尿苷， 4. 肌苷， 5. 鳥苷?qǐng)D1 對(duì)照品色譜Fig. 1 HPLC chromatogram of standard sample

1. 尿嘧啶， 2. 次黃嘌呤， 3. 尿苷， 4. 肌苷， 5. 鳥苷?qǐng)D2 供試品色譜Fig. 2 HPLC chromatogram of test sample

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱定尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷對(duì)照品適量，置100 mL量瓶中，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水制成每1 mL分別含尿嘧啶7.42 μg、次黃嘌呤63.00 μg、尿苷31.80 μg、肌苷306.00 μg、鳥苷20.80 μg的混合對(duì)照品溶液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定上述過(guò)篩后的廣地龍粉末約2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%生理鹽水20 mL，密塞，搖勻，稱量；浸泡30 min后冰浴超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)60 min，放冷，再次稱量，用生理鹽水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取上清液離心15 min(13 000 r/min)，即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取2.2節(jié)混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12、15 μL，分別注入液相色譜儀，按2.1節(jié)色譜條件測(cè)定。分別以對(duì)照品的量X(ng)為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，具體結(jié)果見表2。

表2 廣地龍中5種核苷類成分線性考察結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定6次，并分別計(jì)算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷和鳥苷峰面積的RSD(n=6)，RSD值分別為 0.39%、0.56%、0.45%、0.23%和0.52%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品按2.3節(jié)供試品溶液制備方法平行制備6份，按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)峰面積計(jì)算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的RSD分別為2.36%、1.34%、1.01%、1.59%、1.33%，表明該方法的重復(fù)性好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取1號(hào)樣品按2.3節(jié)制備供試品溶液，分別于0、4、6、8、10、12 h按2.1節(jié)色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)峰面積計(jì)算尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的RSD分別為2.17%、1.73%、1.89%、0.82%、1.68%，表明廣地龍供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱定已知含量的1號(hào)廣地龍樣品9份，每份約1 g，分別精密加入低、中、高劑量的尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷對(duì)照品，按2.3節(jié)方法制備供試品溶液，按2.1節(jié)色譜方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算表明尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷平均加樣回收率分別為99.27%、99.14%、98.59%、98.69%、99.91%，RSD分別為0.95%、0.86%、1.01%、0.86%、1.91%，表明方法的準(zhǔn)確度較好。

2.9 樣品含量測(cè)定

取20批不同產(chǎn)地的廣地龍樣品，分別按2.3節(jié)方法制備樣品溶液，按2.1節(jié)方法進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算各樣品中尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷的含量，結(jié)果見表3。

表3 20批廣地龍樣品中核苷類成分含量測(cè)定結(jié)果

結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地廣地龍中5種核苷類成分的含量差異很大，總含量最高為4號(hào)樣品(4.565 9 mg/g) ，最低為2號(hào)樣品(3.309 9 mg/g)，4、6、7、8、10、11、12、13、14、15、19、20號(hào)樣品中核苷類成分總含量較高，均超過(guò)了平均含量(4.210 4 mg/g)，其余樣品的總含量較少，與平均值相差較大。所有產(chǎn)地的廣地龍中均含有尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、肌苷、鳥苷這5種核苷類成分，平均含量由大到小依次為：肌苷(3.022 8 mg/g)、次黃嘌呤(0.602 1 mg/g)、尿苷(0.295 9 mg/g)、鳥苷(0.214 9 mg/g)、尿嘧啶(0.074 7 mg/g)，各產(chǎn)地廣地龍中肌苷的含量均較高，尿嘧啶含量均較低，說(shuō)明廣地龍中5種核苷類成分含量差異較大。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

根據(jù)核苷類成分的理化特性[19-20]，分別考察不同提取方式(加熱回流提取、超聲提取)、不同提取溶劑(生理鹽水、純水、體積分?jǐn)?shù)10%甲醇、體積分?jǐn)?shù)10%乙醇)、不同料液比(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80, g∶mL)和不同提取時(shí)間(30、60、90 min)對(duì)其提取量的影響。結(jié)果表明：①提取方式選擇：加熱回流提取和超聲提取對(duì)廣地龍的提取無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但超聲提取法更加簡(jiǎn)捷，故選擇超聲的提取方法，期間發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)水溫會(huì)隨時(shí)間增長(zhǎng)而升高，故以冰浴超聲方式代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴超聲，去除超聲過(guò)程中溫度帶來(lái)的影響；②最佳提取溶劑為生理鹽水；③最佳料液比為1∶10；④最佳提取時(shí)間為60 min。

3.2 色譜條件優(yōu)化

色譜柱考察：通過(guò)對(duì)ZORBAX SB-C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)、FNG-AQ C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm, 5 μm)3種不同色譜柱進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①FNG-AQ C18色譜柱：尿嘧啶和次黃嘌呤色譜峰與樣品基質(zhì)色譜峰重疊現(xiàn)象較嚴(yán)重，分離效果不好；②ZORBAX SB-C18色譜柱：尿嘧啶、次黃嘌呤及尿苷色譜峰與樣品基質(zhì)色譜峰重疊現(xiàn)象較嚴(yán)重；③Diamonsil C18色譜柱：對(duì)供試品溶液各色譜峰的分離效果較好。綜合各色譜柱的色譜峰分離效果，最終選擇Diamonsil C18色譜柱。

流動(dòng)相考察：在流動(dòng)相的選擇過(guò)程中[21-25]，通過(guò)考察乙腈-水、甲醇-水、甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液、甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸溶液和甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%磷酸溶液對(duì)峰形的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以甲醇-水(5∶95)作為流動(dòng)相時(shí)，供試品溶液的峰形及分離效果最優(yōu)。

流速及柱溫考察：比較不同流速(0.6、0.8和1.0 mL/min)和不同柱溫(25、30和35 ℃)下各待測(cè)成分的分離度，發(fā)現(xiàn)供試品溶液在流速1.0 mL/min、柱溫30 ℃下有較好的分離。

檢測(cè)波長(zhǎng)考察：在波長(zhǎng)選擇的過(guò)程中[21-25]，通過(guò)DAD全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)供試品溶液在254 nm下各待測(cè)成分吸收值最大，因此選擇254 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

總的來(lái)說(shuō)，在色譜條件探索過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，色譜峰峰形對(duì)流動(dòng)相比例的變化較敏感，甲醇用量是一個(gè)較為敏感的因素，過(guò)大分離度不好，過(guò)小會(huì)影響色譜柱的使用壽命，但柱溫對(duì)分離度影響不大。

3.3 不同批次廣地龍中5種核苷類成分含量的差異

課題組通過(guò)實(shí)地調(diào)研、DNA鑒別，采購(gòu)傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)廣東、廣西的廣地龍樣品，保障藥材來(lái)源的可靠性。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用HPLC法同時(shí)測(cè)定藥材中幾種化合物含量能高效地確定其含量[26-28]。因此，本研究采用HPLC法同時(shí)測(cè)定20個(gè)不同產(chǎn)地廣地龍中5種核苷類成分的含量，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地核苷類化合物含量差異較大，有些產(chǎn)地含有較高或者含有較低含量的特定核苷類化合物，這為廣地龍的產(chǎn)地確定和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新思路。

4 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定廣地龍藥材中5種核苷類成分含量的方法，其色譜條件為：色譜柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(5∶95，體積比)；流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，運(yùn)行時(shí)間20 min。

本研究表明：該方法可用于不同產(chǎn)地廣地龍藥材5種核苷類成分含量的測(cè)定，對(duì)廣地龍質(zhì)量控制研究有顯著意義。