王甲南，崔大煒，吳曰清，陳建祿，李欣諭，金宏遠(yuǎn)，楊清波

[1. 遵義醫(yī)科大學(xué)第五附屬(珠海)醫(yī)院普通外科，廣東 珠海 519100；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院普通外科，遼寧 沈陽 110032]

胃癌是目前全球第5大常見惡性腫瘤，每年約有72.3萬人死于胃癌[1]。早期胃癌切除術(shù)后患者5 a生存率為90%，晚期患者5 a生存率接近10%[2]。進(jìn)展期胃癌一般采用手術(shù)和(或)化療治療，但復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移很常見[3-4]。疾病的診斷較晚和表現(xiàn)各異，加上普遍缺乏有效的治療方法來對(duì)抗疾病的異質(zhì)性，是造成高死亡率的主要原因[5]。雖然手術(shù)是胃癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但早期發(fā)現(xiàn)、診斷和治療是能夠降低死亡率的唯一途徑[6]。通過胃癌篩查可以降低胃癌特異性死亡率，提高胃癌患者的生存率[7]。因此，可靠的生物標(biāo)志物對(duì)于簡(jiǎn)單、快速的癌癥診斷以及可靠、廣泛適用的治療方案的選擇具有重要意義。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)目前被定義為長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的一種非編碼RNA，在人類正常和疾病狀態(tài)中具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。許多l(xiāng)ncRNA在胃癌中表達(dá)失調(diào)，與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、預(yù)后或診斷密切相關(guān)，在胃癌的診斷和預(yù)后中顯示出潛在的生物標(biāo)志物作用[9]。自發(fā)現(xiàn)膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(bladder cancer associated transcript-1，BLACAT1)在膀胱癌組織中高度上調(diào)以來[10]，lncRNA BLACAT1在多種實(shí)體瘤患者組織和血漿中也被發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)[11-12]。BLACAT1上調(diào)驅(qū)動(dòng)胃癌細(xì)胞的特性，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等[13]。然而，關(guān)于胃癌組織中BLACAT1與自噬的關(guān)系尚不清楚，BLACAT1在人胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)模式、生物學(xué)作用以及在胃癌進(jìn)展中的潛在機(jī)制仍有待研究。本研究通過檢測(cè)BLACAT1在人胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況，探討其對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和自噬水平的影響以及對(duì)自噬調(diào)控的潛在機(jī)制，以探究胃癌治療的新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 胃癌標(biāo)本收集收集2017年8月至2018年9月期間在遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查確診為胃癌的標(biāo)本53例，均為原發(fā)病灶，并經(jīng)2名病理科醫(yī)師證實(shí)，離體后放入液氮中保存。全部患者術(shù)前未行放、化療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在患者簽署知情同意書后進(jìn)行。

1.2 主要試劑Trizol試劑購自美國(guó)Invitrogen公司；人正常胃上皮黏膜細(xì)胞系GES-1，胃癌細(xì)胞系SGC-7901、MGC-803、BGC-823均購自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫；RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國(guó)HyClone公司；體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑購買自美國(guó)Invitrogen公司；cDNA試劑盒Prime Script RT kit購買自日本TaKaRa公司；RIPA裂解液購自上海碧云天公司；siRNA均購自上海吉瑪公司；Lip2000購自美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 GES-1、SGC-7901、MGC-803、BGC-823細(xì)胞系均在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和100 u/mL青霉素鈉RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，環(huán)境為含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的37 ℃濕潤(rùn)環(huán)境。靶向BLACAT1的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)，包括si-BLACAT1、si-control和si-ATG3、si-NC由上海吉瑪公司合成。si-BLACAT1序列如下：5’-GAATTAGAAGCGAGGGGTT-3’。BLACAT1過表達(dá)質(zhì)粒購自上海吉瑪公司，選用pcDNA3.1空白載體作為陰性對(duì)照。分別設(shè)立BLACAT1干擾組(si-BLACAT1)和陰性轉(zhuǎn)染組(si-control)，BLACAT1過表達(dá)組(pcDNA3.1- BLACAT1)和對(duì)照組(pcDNA3.1)，ATG3干擾組(si-ATG3)和陰性轉(zhuǎn)染組(si-NC)。

將SGC-7901、BGC-823細(xì)胞按每孔5×105個(gè)種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，通過Lipofectamine 2000儀器，分別用si-BLACAT1和si-control、pcDNA3.1- BLACAT1和pcDNA3.1、si-ATG3和si-NC轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h后收獲細(xì)胞用于實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，72 h后用于Western blot檢測(cè)。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR 采用Trizol試劑從胃癌細(xì)胞系和組織中提取總RNA。利用Prime Script RT kit合成cDNA。采用美國(guó)Invitrogen公司合成實(shí)時(shí)定量PCR引物，BLACAT1序列為:正向：5’-TGACGTCTTACTACACCCATCCT-3’，反向：5’-CTGCCACCTATAGGAAATGCG-3’。β-actin作為內(nèi)部參照,以下引物序列被用來放大β-actin，正向：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3’和反向：5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，并用2-ΔΔCT法計(jì)算并標(biāo)準(zhǔn)化BLACAT1表達(dá)。

1.3.3 免疫熒光試驗(yàn) 使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定胃癌細(xì)胞，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1% Triton x-100 處理細(xì)胞15 min。將穩(wěn)定表達(dá)的胃癌細(xì)胞接種于細(xì)胞孔，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)到70%左右分別加入si-BLACAT1和si-control、pcDNA3.1-BLACAT1和pcDNA3.1，再放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。后加入一抗、二抗，滴加DAPI復(fù)染核，在激光掃描顯微鏡下觀察LC3發(fā)光情況。

1.3.4 Western blot 收集胃癌細(xì)胞，用RIPA裂解緩沖液裂解。提取等量的蛋白質(zhì)(30 μg)經(jīng)SDS-PAGE電泳分離, 然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% Tween-20的Tris緩沖液中，用體積分?jǐn)?shù)5%脫脂牛奶封閉膜，然后與LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、ATG3特異性抗體封閉過夜(15 000;美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。后在37 ℃條件下與山羊、兔抗體IgG孵育(11 000) 2 h, 結(jié)合蛋白的可視化使用ECL和Bio-Imaging System檢測(cè)。蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化用β-actin (110 000)。

1.3.5 CCK-8 法測(cè)定胃癌細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞接種于96孔板中(5×103個(gè)/孔)，分別于24、48、72、96 h 后終止培養(yǎng)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% CCK-8培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中孵育3 h。最后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值(OD450)。

2 結(jié)果

2.1 BLACAT1在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)胃癌組織中的BLACAT1的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。實(shí)時(shí)定量PCR用于分析GES-1、SGC-7901、MGC-803、BGC-823細(xì)胞系中BLACAT1表達(dá)。結(jié)果表明，各胃癌細(xì)胞系中BLACAT1表達(dá)高于正常胃細(xì)胞系，其中胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823的BLACAT1表達(dá)水平相對(duì)較高，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)(P均<0.05，圖1)。

2.2 敲除BLACAT1抑制胃癌細(xì)胞的增殖與si-control相比，si-BLACAT1質(zhì)粒的敲除后BLACAT1降低率分別為70%與64%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，圖2)。CCK-8用于檢測(cè)敲除BLACAT1后對(duì)胃癌細(xì)胞系SGC-7901、BGC-823增殖能力影響。結(jié)果顯示，敲除BLACAT1后胃癌細(xì)胞的增殖能力較si-control顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.3 敲除BLACAT1抑制胃癌細(xì)胞自噬與si-control相比，si-BLACAT1自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比例明顯降低，表明細(xì)胞自噬水平受到抑制(圖4)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)用于進(jìn)一步研究敲除BLACAT1對(duì)自噬水平影響，可見LC3熒光斑點(diǎn)在si-BLACAT1組中降低，即敲除BLACAT1能夠抑制胃癌細(xì)胞的自噬水平(圖5)。

圖1 lncRNA BLACAT1在胃癌組織(A)和細(xì)胞系(B)中的表達(dá)

圖2 敲除BLACAT1對(duì)SGC-7901(A)、BGC-823(B)細(xì)胞系增殖的影響

圖3 敲除BLACAT1對(duì)SGC-7901(A)、BGC-823(B)細(xì)胞系增殖的影響

2.4 敲除BLACAT1抑制自噬相關(guān)蛋白ATG3的表達(dá)與si-control相比，敲除BLACAT1降低ATG3蛋白表達(dá)水平，即si-BLACAT1能夠上調(diào)SGC-7901、BGC-823細(xì)胞系中ATG3的表達(dá)(圖6)。

圖6 敲除BLACAT1對(duì)SGC-7901(A)、BGC-823(B)細(xì)胞系自噬相關(guān)蛋白ATG3表達(dá)的影響

3 討論

LncRNA通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳信號(hào)等多種復(fù)雜機(jī)制，在調(diào)控腫瘤行為中發(fā)揮重要作用[8]。然而，關(guān)于lncRNA在胃癌組織中的表達(dá)和功能的數(shù)據(jù)有限。研究表明，lncRNA BLACAT1具有促癌活性，是結(jié)直腸癌[14]、膀胱癌[10]和胃癌[15]患者的預(yù)后不良的指標(biāo)。本文結(jié)果顯示，lncRNA BLACAT1在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。LncRNA BLACAT1的診斷和預(yù)后價(jià)值一直被關(guān)注。例如，已證實(shí)多種惡性腫瘤患者的血清和組織中l(wèi)ncRNA BLACAT1的表達(dá)水平均較非惡性腫瘤者顯著上調(diào)，且血清lncRNA BLACAT1具有較高的診斷性能[12]，這表明lncRNA BLACAT1在胃癌診斷中可能具有生物標(biāo)志物的潛力。在非小細(xì)胞肺癌中，lncRNA BLACAT1表達(dá)上調(diào)，沉默lncRNA BLACAT1可在體內(nèi)外抑制增殖、遷移、侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯，lncRNA BLACAT1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)揮致癌作用[16],我們證實(shí)了這一觀察結(jié)果，體外敲除lncRNA BLACAT1可抑制胃癌細(xì)胞增殖，提示lncRNA BLACAT1可能是胃癌的致癌基因。

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)溶酶體參與蛋白質(zhì)和細(xì)胞器降解的途徑，與人類疾病和生理聯(lián)系緊密[17]。近年來越來越多研究證實(shí)自噬與腫瘤發(fā)展的密切關(guān)系[18-19]。然而，在惡性腫瘤發(fā)展過程中，自噬被證明具有雙重作用。在某些情況下，自噬是一種腫瘤抑制機(jī)制，但在另一些情況下，自噬促進(jìn)腫瘤發(fā)生[20-21]。我們用si-BLACAT1轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，抑制自噬體形成。而敲除BLACAT1時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，提示BLACAT1可能通過促進(jìn)自噬參與腫瘤發(fā)生過程。然而，盡管本研究有相關(guān)數(shù)據(jù)，但自噬與細(xì)胞凋亡尤其是腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

自噬涉及多個(gè)步驟:起始、成核、伸長(zhǎng)、形成自噬體的膜的閉合、與溶酶體的融合以及大分子前體的循環(huán)，特定的自噬相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)每個(gè)步驟[22]。ATG3的乙?；鰪?qiáng)了其與含磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)合，是促進(jìn)ATG8/LC3-磷脂酰乙醇胺綴合物形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子[23]。研究[24-25]發(fā)現(xiàn)，多種lncRNA可以通過ATG3調(diào)控自噬水平。但ATG3在胃癌中的作用目前尚未完全清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，敲除BLACAT1抑制ATG3的表達(dá)，通過共轉(zhuǎn)染pcDNA3.1- BLACAT1和si-ATG3后，胃癌細(xì)胞自噬水平受到顯著抑制。說明BLACAT1對(duì)自噬的調(diào)控是通過ATG3實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實(shí)lncRNA BLACAT1在胃癌中表達(dá)升高。通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)lncRNA BLACAT1敲除可抑制胃癌細(xì)胞增殖和自噬；并且我們發(fā)現(xiàn)敲除lncRNA BLACAT1能抑制自噬相關(guān)蛋白ATG3的表達(dá)。這說明lncRNA BLACAT1對(duì)胃癌細(xì)胞自噬的調(diào)控可能與ATG3有關(guān)。本研究為lncRNA BLACAT1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的機(jī)制研究奠定了理論基礎(chǔ)。