楊杰仲 魏善元 陳 旭 朱森林 楊 珍 杜慕云 楊仁德*

（1貴州省中藥材現(xiàn)代化研究所，貴州貴陽(yáng)550006；2貴州省土壤肥料研究所，貴州貴陽(yáng)550006）

靈芝（Ganoderma lingzhi）是擔(dān)子菌門、傘菌綱、多孔菌目、靈芝科、靈芝屬真菌[1]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（2015年版）記載，赤芝和紫芝具有補(bǔ)氣安神，止咳平喘功效；主治眩暈不眠，心悸氣短，虛勞咳喘[2]。藥理研究證明，靈芝及其有效成分具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保護(hù)放化療損傷、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛、強(qiáng)心與抗心肌缺血、抗腦缺氧、抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性、抑制膽固醇合成及調(diào)節(jié)血脂、降血糖、抑制血小板凝集、增強(qiáng)DNA多聚酶活性、促進(jìn)核酸和蛋白質(zhì)合成、提高缺氧耐受力、抗氧化清除自由基、抗衰老等作用[3]。靈芝孢子是靈芝生長(zhǎng)發(fā)育后期產(chǎn)生的種子，是靈芝的精華。靈芝孢子有一層極難被人體消化的由幾丁質(zhì)構(gòu)成的外壁，未破壁的孢子粉的有效成分人體利用率低，只有打開這層外壁，有效成分才能充分釋放被人體吸收利用。超微粉碎技術(shù)是一種將各種固體物質(zhì)粉碎成直徑小于10μm粉體的高科技工業(yè)技術(shù)，是近20年來(lái)迅速發(fā)展形成的一種新技術(shù)，這一技術(shù)以最大限度細(xì)胞破壁為目的。采用超微粉碎技術(shù)，使靈芝孢子在粉碎過(guò)程中，受到強(qiáng)烈的正向擠壓力和切向剪切力，細(xì)胞被擠壓、剪切，細(xì)胞壁被撕裂，細(xì)胞被破碎成碎片或者被壓破，細(xì)胞內(nèi)的有效成分直接暴露出來(lái)，加速有效成分的浸出，促進(jìn)溶解和吸收，從而提高生物利用率。試驗(yàn)旨在明確用超微粉碎技術(shù)制備破壁靈芝孢子粉相關(guān)參數(shù)，以獲得好的破壁效果。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

靈芝孢子粉，為赤靈芝孢子粉，由貴州星原生物科技有限公司生產(chǎn)基地提供；蒽酮、濃硫酸、無(wú)水乙醇均為分析純，水為蒸餾水。

超微粉碎機(jī)，煙臺(tái)慧寶設(shè)備制造有限公司；Nicomp 380 ZLS激光納米粒度測(cè)定儀，美國(guó)Particle Sizing Systems公司；顯微鏡XS-212-201型、CT6T臺(tái)式多用途離心機(jī)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝孢子粉超微粉碎單因素試驗(yàn)

選取對(duì)孢子破壁率有直接影響的兩個(gè)因素，即粉碎機(jī)轉(zhuǎn)速和粉碎時(shí)間，計(jì)算不同條件下靈芝孢子的破壁率，以確定最佳破壁條件。

1.2.2 靈芝孢子破壁前后掃描電鏡觀察

取少量干燥破壁和未破壁孢子粉，分別在掃描電鏡下掃描觀察。

1.2.3 靈芝孢子破壁率的計(jì)算

1.2.3.1 孢子計(jì)數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn) 確 稱 取 0.0 050 g、0.0 100 g、0.0 150 g、0.0 200 g、0.0 250 g、0.0 500 g、0.0 600 g、0.0 700 g未破壁靈芝孢子粉，分別置于容量瓶中，加適量蒸餾水，置于微波振蕩器中充分震蕩，打散孢子團(tuán)，定容至刻度線，混勻。然后用血球計(jì)數(shù)板依次對(duì)該系列懸浮液中的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。按對(duì)角線法取5個(gè)大格為1個(gè)計(jì)數(shù)單位，每個(gè)濃度的孢子懸浮液取8個(gè)計(jì)數(shù)單位的平均值。最后以靈芝孢子粉稱樣量與每個(gè)計(jì)數(shù)單位孢子平均數(shù)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 破壁率計(jì)算方法

精密稱取一定量破壁孢子粉，用1.2.3.1中所述方法進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，按下述公式進(jìn)行破壁率的計(jì)算。

A=（Y-n）/Y×100%

圖1 靈芝孢子粉破壁前后電鏡掃描照片

式中：A為破壁率；Y為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得待測(cè)孢子粉的每個(gè)計(jì)數(shù)單位孢子平均數(shù)；n為用血球計(jì)數(shù)板測(cè)得每個(gè)濃度孢子懸浮液的計(jì)數(shù)單位孢子的平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝孢子破壁前后電鏡圖片比較

取少量干燥破壁和未破壁孢子粉，分別在掃描電鏡下掃描觀察。由電鏡掃描圖可看出，破壁前的靈芝孢子粉顆粒清晰能辨認(rèn)，有堅(jiān)硬的雙層壁；經(jīng)超微粉碎后，靈芝孢子粉顆粒不能辨認(rèn)數(shù)數(shù)，孢子壁被全部打碎（圖1），有效成分充分釋放。

2.2 超微粉碎機(jī)轉(zhuǎn)速、時(shí)間對(duì)破壁率的影響

超微粉碎機(jī)通過(guò)兩個(gè)高速自轉(zhuǎn)的粉碎環(huán)獲得一種強(qiáng)大的離心力和剪切力破碎孢子粉壁（傳統(tǒng)粉碎機(jī)粉碎介質(zhì)得不到），影響破壁率的主要因素有粉碎機(jī)的主軸轉(zhuǎn)速以及粉碎時(shí)間。

圖1 超微粉碎機(jī)轉(zhuǎn)速對(duì)破壁率的影響

由圖1可以看出，隨著主軸轉(zhuǎn)速的提高，破壁率幾乎是呈線性上升，轉(zhuǎn)速越大，施加在主軸上剪切力和壓縮力也隨著增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到2 200 r/min時(shí)，破壁率可以達(dá)到96%，而轉(zhuǎn)速為2 300 r/min以上時(shí)，破壁率并無(wú)明顯上升，所以破壁最佳轉(zhuǎn)速選定為2 200 r/min。

圖2 粉碎時(shí)間對(duì)破壁率的影響

由圖2可以看出，破壁前20 min，破壁率上升顯著，20 min以后，破壁率的上升比較緩慢。這是因?yàn)殡S著破壁時(shí)間的延長(zhǎng)，未被粉碎的孢子越少，其與筒壁及粉碎環(huán)接觸的概率下降，被粉碎的概率也相應(yīng)下降，所以破壁20 min為最佳工作時(shí)間。

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)速為2 200 r/min、粉碎時(shí)間為20 min時(shí)，靈芝孢子壁破壁效果好，破壁率可以達(dá)到96%。但孢子的破壁率達(dá)到96%后，就不再隨轉(zhuǎn)速和時(shí)間增加而提升，不能達(dá)到100%。這可能是由于孢子本身粒徑太小，小于粉碎環(huán)和筒壁之間的最小間隙距離，使得總有少量的靈芝孢子未能受到足夠的剪切力作用，從而孢子壁未被破壞。