魏曉楠 王娜 伊茂禮 弭苗苗 張貴麗 孫成銘

[摘要] 目的 利用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）芯片法對疑似下呼吸道感染病人進(jìn)行13種病原體檢測，評(píng)價(jià)該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 收集2017年就診于我院的疑似下呼吸道感染病人的深部痰液標(biāo)本2 029例及肺泡灌洗液標(biāo)本246例，分別采用LAMP芯片法和分離培養(yǎng)技術(shù)對病原體進(jìn)行檢測。以培養(yǎng)法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，對LAMP芯片法進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果 在深部痰液標(biāo)本中，LAMP芯片法和普通培養(yǎng)法檢測的總陽性率分別為57.96%（1 176/2 029）和10.50%（213/2 029），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=101.511，P<0.01）;兩種方法對銅綠假單胞菌的檢出一致性最高（Kappa=0.651，95%CI=0.561～0.741）。痰液標(biāo)本中流感嗜血桿菌的檢出率最高，為21.24%（431/2 029）。深部痰液和肺泡灌洗液檢出的病原體種類及陽性率均存在明顯差異。結(jié)論 LAMP芯片法可對下呼吸道感染病人痰液及肺泡灌洗液中的病原體，尤其是苛養(yǎng)菌和不可培養(yǎng)病原體進(jìn)行快速檢測，其檢出陽性率明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法，且其檢測快速可靠，適于在基層醫(yī)院中推廣。

[關(guān)鍵詞] 呼吸道感染;病原;核酸擴(kuò)增技術(shù);芯片分析技術(shù)

[中圖分類號(hào)] R446.5;R517.6 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] 2096-5532（2020）02-0207-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.053 [開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200325.1005.005.html;2020-03-026 11：30

[ABSTRACT] Objective To evaluate the clinical value of the on-chip loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay by testing patients with suspected lower respiratory tract infection （LRTI） for 13 pathogens using the LAMP assay. ?MethodsA total of 2 029 deep sputum specimens and 246 bronchoalveolar lavage fluid （BALF） specimens were collected from patients with suspected LRTI who attended our hospital in 2017. The patients were tested for pathogens using the on-chip LAMP assay and pathogen isolation and culture technique. The methodology of the on-chip LAMP assay was evaluated using the pathogen culture method as the “gold standard”. ?Results The overall positive rates of the on-chip LAMP assay and conventional culture method in sputum specimens were 57.96% （1 176/2 029） and 10.50% （213/2 029）， respectively， with a significant difference observed between the two methods （χ2=101.511，P<0.01）. The two methods had the highest detection consistency for Pseudomonas aeruginosa （Kappa=0.651，95% confidence interval： 0.561-0.741）. The detection rate of Haemophilus influenzae in sputum specimens was highest （21.24%，431/2 029）. There were significant differences in the type and positive rate of pathogens between deep sputum and BALF specimens. ?Conclusion The on-chip LAMP assay can be used for rapid detection of pathogens in sputum and BALF specimens collected from patients with LRTI， especially the fastidious bacteria and non-culturable pathogens， the positive detection rate for which is significantly higher than that with conventional culture method. The LAMP assay is fast and reliable， which makes it suitable for application in primary hospitals.

[KEY WORDS] respiratory tract infections; noxae; nucleic acid amplification techniques; microchip analytical procedures

2.4 兩種方法檢測結(jié)果的一致性分析

在痰液標(biāo)本中，普通培養(yǎng)法檢測的總陽性率為10.50%（213/2 029），與LAMP芯片法比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=101.511，P<0.01）。LAMP芯片法與培養(yǎng)法檢出病原體共同陽性174例，LAMP芯片法檢出陽性而培養(yǎng)法陰性1 559例，兩種方法檢測結(jié)果一致性見表4。在13種病原體中，兩種方法檢出銅綠假單胞菌的一致性最高（Kappa=0.651，95%CI=0.561～0.741）。

3 討 ?論

下呼吸道感染是一個(gè)全球范圍的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，它常為多種呼吸系統(tǒng)疾病的誘因，并涉及種類繁多的病原體。目前，在短時(shí)間內(nèi)做出明確的病原學(xué)診斷并進(jìn)行有針對性的治療依然很困難，這也是該病死亡率高的主要原因[6]。實(shí)踐證明，定期或者不定期地對呼吸道疾病的流行病學(xué)特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可以為疾病預(yù)防控制提供干預(yù)依據(jù)[7]。預(yù)防為主、準(zhǔn)確診斷、及時(shí)治療，是防治該病的基本原則，而明確引起感染的病原體和針對性藥物的選擇配伍則是降低該病死亡率的重要保證。下呼吸道感染多由細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體等病原體引起[8]，受目前技術(shù)所限，除細(xì)菌外的其他病原體的常規(guī)培養(yǎng)，臨床微生物室尚難以開展。因此，一種特異性高、覆蓋面廣、檢測靈敏快速的病原體診斷方法——LAMP技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

2000年，這種以鏈置換酶核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的LAMP被NOTOMI等[9]首次報(bào)道。LAMP利用針對6個(gè)靶基因區(qū)域而設(shè)計(jì)的4對特異性引物，通過鏈置換DNA聚合酶在恒溫條件下（65 ℃左右），形成一系列不同大小的具有多個(gè)靶DNA反向重復(fù)串聯(lián)序列的產(chǎn)物。該方法不需要傳統(tǒng)PCR的嚴(yán)苛條件和觀察步驟，整個(gè)反應(yīng)過程僅需15～60 min即可完成[10]。LAMP從標(biāo)本處理到報(bào)告結(jié)果全過程僅需2 h，尤其適用于基層醫(yī)院及軍隊(duì)野戰(zhàn)醫(yī)院，故一經(jīng)報(bào)道就受到了廣泛的關(guān)注[11]。LAMP的特異性和敏感性很高，操作及檢測方法簡單，且芯片法檢測結(jié)果不易出現(xiàn)污染、自動(dòng)化程度高、試劑損耗低、檢測病原體覆蓋面廣，具備了對呼吸道感染性疾病的快速診斷能力[12]。

本研究以商品化LAMP試劑盒對疑似下呼吸道感染病人的標(biāo)本進(jìn)行了13種病原體的檢測，結(jié)果表明，流感嗜血桿菌是最主要下呼吸道致病菌，其次為肺炎鏈球菌和肺炎支原體，該結(jié)果與我院同期微生物室呼吸道標(biāo)本分離細(xì)菌分布情況大致相同，但與同年全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)發(fā)布的數(shù)據(jù)略有差異。這可能與地域差異有關(guān);另外，由于流感嗜血桿菌對環(huán)境的要求較為嚴(yán)格，采集及運(yùn)輸方式不當(dāng)，對培養(yǎng)陽性率的影響也較大[13]。本研究中，女性病人肺炎支原體的陽性率較男性高，而男性病人肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌的陽性率高于女性。這可能與女性和男性的生理及免疫差異有關(guān)，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。各年齡組間比較，8種下呼吸道病原體陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示下呼吸道病原體感染與年齡有一定的關(guān)系。這與鄭才玲等[14]的報(bào)道較為一致。流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、肺炎支原體的陽性率在少年組最高，這與少年人群免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，且長期活動(dòng)于學(xué)校等人群密集度較高的場所，呼吸道病原體的傳播更容易且迅速，從而導(dǎo)致相關(guān)病原體陽性檢出率偏高[15]。肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌陽性率則在老年組最高，這與老年病人基礎(chǔ)疾病多、住院率高、院內(nèi)感染率高有關(guān)。深部痰液和肺泡灌洗液檢出的病原體種類及陽性率均存在明顯差異，肺泡灌洗液中流感嗜血桿菌的檢出率較低，而肺炎支原體的檢出率較高。這可能是由于不同病原體的定植位置不同而導(dǎo)致的，肺炎支原體常黏附于肺泡上皮細(xì)胞上，通過肺泡灌洗后能于灌洗液中富集，因此檢出率會(huì)更高[16];而流感嗜血桿菌等常定植于上呼吸道，因此通過自然咳痰的方法更易被檢出[17]。

LAMP芯片法對某些苛養(yǎng)菌（如肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌等）的檢出率比常規(guī)培養(yǎng)法更高，對支原體等難以常規(guī)培養(yǎng)的病原體更有培養(yǎng)法所無法比擬的優(yōu)勢。由于抗生素的廣泛使用，很多病人在留取標(biāo)本前可能已經(jīng)使用了某些抗生素，這會(huì)對培養(yǎng)的陽性率造成嚴(yán)重影響;另外，某些病原體對培養(yǎng)條件要求苛刻，需要特殊的培養(yǎng)基才能生長，培養(yǎng)困難或根本無法培養(yǎng)，這也是造成培養(yǎng)陽性率低的一大因素。如流感嗜血桿菌培養(yǎng)條件特殊，X因子（正鐵血紅素）、V因子（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）是其生長的必須因子，臨床分離、培養(yǎng)時(shí)巧克力平板的V因子在常溫或高溫下容易失去活性，導(dǎo)致流感嗜血桿菌在培養(yǎng)基上生長差或不生長，經(jīng)常被漏檢[18]。肺炎鏈球菌在體外生存能力較弱，對培養(yǎng)的營養(yǎng)要求高，可產(chǎn)生自溶酶，在經(jīng)驗(yàn)不足的基層實(shí)驗(yàn)室中使用普通培養(yǎng)基或涂片革蘭染色檢查可將其與草綠色鏈球菌混淆，培養(yǎng)和菌種菌型鑒別過程復(fù)雜，導(dǎo)致培養(yǎng)法陽性率較低[19]。LAMP技術(shù)可從標(biāo)本極其微量的核酸中獲取目的基因[20]，并進(jìn)行擴(kuò)增和放大，靈敏度較普通培養(yǎng)法有質(zhì)的提高。本研究結(jié)果還顯示，兩種方法的診斷一致性較好，尤其是對銅綠假單胞菌的檢出一致性最高，Kappa值可達(dá)0.651。由于嬰幼兒的依從性較差，合格的痰培養(yǎng)標(biāo)本難以獲取，因此病原體陽性檢出率低是困擾嬰幼兒下呼吸道感染診斷的關(guān)鍵問題[21]。LAMP技術(shù)由于采用了特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，在保證了高度特異性的前提下[22]，大大提高了檢出陽性率，這使得該技術(shù)在嬰幼兒下呼吸道感染病原體診斷方面具有絕對的優(yōu)勢。LAMP芯片法還可對結(jié)核分支桿菌復(fù)合群、軍團(tuán)菌[23]、衣原體這3種無法常規(guī)培養(yǎng)的病原體同時(shí)進(jìn)行檢測，可使病原體的覆蓋面更廣，大大提高了診斷的靈敏度[24]。本研究中檢出軍團(tuán)菌4例，結(jié)核分支桿菌復(fù)合群28例，衣原體10例。28例結(jié)核分支桿菌復(fù)合群中，17例抗酸桿菌涂片陰性，我們又對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了測序驗(yàn)證，符合率100%，病人抗結(jié)核治療有效。表明LAMP芯片法可以幫助臨床快速診斷下呼吸道感染并指導(dǎo)臨床合理用藥。

綜上所述，本研究采用LAMP芯片法檢測了本地區(qū)疑似下呼吸道感染病人的病原體分布情況，結(jié)果顯示病原體以流感嗜血桿菌為主，與同期全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)發(fā)布的數(shù)據(jù)略有差異;該方法可對下呼吸道感染病人痰液及肺泡灌洗液中的病原體，尤其是苛養(yǎng)菌和不可培養(yǎng)病原體進(jìn)行快速檢測，檢出陽性率明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。LAMP芯片法操作簡單，可同時(shí)檢測多種病原體，適宜在基層醫(yī)院中推廣和應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] World Health Organization. Global immunization data[R]. Geneva： World Health Organization， 2014.

[2] 劉廣義，劉暢暢，王錫波，等. 醫(yī)院獲得性阻塞性肺炎患者下呼吸道感染苛養(yǎng)菌分布及耐藥特征分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2016，26（14）：3155-3157.

[3] SHESHADRI A， SHAH D P， GODOY M， et al. Progression of the radiologic severity index predicts mortality in patients with parainfluenza virus-associated lower respiratory infections[J]. PLoS One， 2018，13（5）：e0197418.

[4] WEI Shuang， ZHAO Hui， XIAN Yuyin， et al. Multiplex PCR assays for the detection of Vibrio alginolyticus， Vibrio para-haemolyticus， Vibrio vulnificus， and Vibrio cholerae with an internal amplification control[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease， 2014，79（2）：115-118.

[5] 王麗，周光，王磊利，等. 2013—2016年14 383例呼吸道感染患者9種病原體IgM抗體檢測結(jié)果分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2018，28（17）：2579-2582.

[6] TROEGER C， FOROUZANFAR M， RAO P C， et al. Estimates of the global， regional， and National morbidity， morta-lity， and aetiologies of lower respiratory tract infections in 195 countries： a systematic analysis for the Global Burden of Di-sease Study 2015[J]. Lancet Infectious Diseases， 2017，17（11）：1133-1161.

[7] 靳慶娥，蘇建榮，烏姍娜，等. 2015年北京地區(qū)成人急性呼吸道感染9種病原體IgM抗體檢測分析[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2017，32（2）：157-159.

[8] TSANGLAO W R， NANDAN D， CHANDELIA S， et al. Chronic hypersensitivity pneumonia due to pigeon breeders di-sease[J]. Indian Pediatrics， 2017，54（1）：55-57.

[9] NOTOMI T， OKAYAMA H， MASUBUCHI H， et al. Loop-mediated isothermal amplifivation of DNA[J]. Nucleic Acids Research， 2000，28（12）：52-63.

[10] 陳炆穎，陳愉生. 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用[J]. 臨床肺科雜志， 2011，16（3）：410-412.

[11] MOOSAVIAN M， SEYED-MOHAMMADI S， SAKI M， et al. Loop-mediated isothermal amplification for detection of Legionella pneumophila in respiratory specimens of hospitalized patients in Ahvaz， southwest Iran[J]. Infection and Drug Resistance， 2019，12（3）：529-534.

[12] 唐睿珠，羅正瓊，徐秋月，等. 呼吸道病原體核酸恒溫?cái)U(kuò)增芯片十三聯(lián)檢在下呼吸道感染常見病原體基因中的檢測[J]. 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2017，38（1）：8-12.

[13] 田磊，張真，陳中舉，等. 某院流感嗜血桿菌耐藥性及其對氨芐西林耐藥機(jī)制[J]. 中國感染控制雜志， 2015，14（2）：73-76.

[14] 鄭才玲，符春苗，邵運(yùn)祿. ?？诘貐^(qū)呼吸道病原體流行情況分析[J]. 海南醫(yī)學(xué)， 2017，28（19）：3172-3174.

[15] 朱秀芳，胡恩亮，王昱苓. 1 198例肺炎支原體-IgM抗體檢測結(jié)果分析與臨床思考[J]. 西南軍醫(yī)， 2019，21（4）：347-350.

[16] 鄒蘭科，鄧忠天，陳麗娜. 肺泡灌洗液和痰病原菌培養(yǎng)對下呼吸道感染的診斷價(jià)值分析[J]. 解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志， 2019，37（5）：19-20.

[17] GOLLWITZER E S， MARSLAND B J. Microbiota abnormalities in inflammatory airway diseases-potential for therapy[J]. Pharmacology & Therapeutics， 2014，141（1）：32-39.

[18] CHEN Y S， LIU T， LANGFORD P， et al. Haemophilus parasuis induces activation of NF-κB and MAP kinase signaling pathways mediated by toll-like receptors[J]. Molecular Immunology， 2015，65（2）：360-366.

[19] 謝興鳳，張旭，任艷，等. 四川綿陽地區(qū)肺炎鏈球菌流行病學(xué)特征[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志， 2018，30（10）：1155-1159.

[20] ODARI E O， MAIYO A， LWEMBE R， et al. Establishment and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay for the semi-quantitative detection of HIV-1 group M virus[J]. Journal of Virological Methods， 2015，212：30-38.

[21] 王穎穎，余堅(jiān)，章婷婷，等. 肺炎支原體核酸定量在兒童下呼吸道感染患者精準(zhǔn)診療中的價(jià)值[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2019，29（18）：2177-2180.

[22] LEE D， KIM Y T， LEE J W， et al. An integrated direct loop-mediated isothermal amplification microdevice incorporated with an immunochromatographic strip for bacteria detection in human whole blood and milk without a sample preparation step[J]. Biosensors & Bioelectronics， 2016，79：273-279.

[23] 楊俊發(fā)，許飛. LAMP結(jié)合基因芯片技術(shù)在快速檢測嗜肺軍團(tuán)菌中的應(yīng)用[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志， 2013，29（14）：2383-2385.

[24] KAKUYA F， KINEBUCHI T， FUJIYASU H， et al. Genetic point-of-care diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection using LAMP assay[J]. Pediatrics International： Official Journal of the Japan Pediatric Society， 2014，56（4）：547-552.

（本文編輯 馬偉平）