吳雙，柯裕豐，朱善元，吳植，姜勇,2，謝軍

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300；2. 揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是養(yǎng)雞行業(yè)的“頭號殺手”之一，也是危害最大的傳染病病原之一[1]。NDV具有囊膜，其囊膜表面含有一定數(shù)量的血凝素，能夠凝集雞、鴨、鵝、豚鼠和人的“O型血”的紅細胞[2]，以及非洲綠猴腎細胞[3]。故可用HA試驗檢測尿囊液中病毒是否具有血凝性，在HA試驗結(jié)果基礎上可以進行血凝抑制試驗，進而明確該養(yǎng)禽場的新城疫抗體水平。HA試驗具有操作簡便、快速和實用性強等特點，但影響因素較多[4]。涉及1%紅細胞懸液的保存時間、抗凝血在4 ℃保存時間、抗原凍融次數(shù)、凍融的抗原在4 ℃保存時間、不同稀釋液對HA結(jié)果的影響，延長1%紅細胞懸液的保存時間等問題。為了減少影響因素的干擾，同時也為實際操作提供參考建議，本文對HA試驗上述諸多影響因素進行了研究。

1 材料與方法

1.1 生物材料

SPF雛雞和SPF種蛋均購自浙江立華農(nóng)業(yè)科技有限公司。SPF雛雞由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室在禽隔離器飼養(yǎng)至成年；SPF種蛋自行孵化至10日齡。新城疫活疫苗(LaSota)購自青島易邦生物工程有限公司。

1.2 HA試驗操作

參考GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術(shù)文件，進行HA試驗規(guī)范操作，在正確使用移液器的前提下，確保抗原倍比稀釋的準確性[5-6]，充分混勻后在室溫(20～25 ℃)下靜置反應，當不加LaSota尿囊液對照孔的紅細胞呈明顯鈕扣狀時判讀結(jié)果，以完全凝集的病毒最大稀釋度為該NDV的血凝效價[7-8]。

1.3 NDV LaSota尿囊液的擴繁

NDV疫苗株LaSota稀釋104倍接種5枚10日齡SPF雞胚尿囊腔，0.1 mL/枚，孵育96 h時收獲尿囊液，每枚雞胚的尿囊液單獨收獲且單獨測定其HA效價；選擇HA效價最高的尿囊液經(jīng)稀釋106倍后接種5枚10日齡SPF雞胚尿囊腔，0.1 mL/枚；按照上述操作再雞胚傳代1次。本試驗中所用的尿囊液來自同一枚雞胚，共收獲6.0 mL尿囊液，每只指形管分裝0.1 mL，共分裝60支，保存于-80 ℃冰箱中，使用前室溫自然融解[9-10]。

1.4 1%紅細胞懸液的制備方法

采血器預先吸取適量的3.8%枸櫞酸鈉溶液并潤濕管壁，按照抗凝劑∶血液=1∶4的比例采集SPF抗凝血。通過翅靜脈或心臟途徑采集血液，將采集的3份抗凝血混勻后取適量抗凝血置入離心管中，加入3倍至4倍體積的稀釋液混勻，分別以2 000 r/min離心3次，第1次5 min，第2次5 min，第3次8 min，棄凈血漿和白細胞，最后吸取壓積紅細胞用稀釋液配成體積分數(shù)為1%的紅細胞懸液，于4 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.5 存放容器種類對抗凝血的影響

按照1.4的操作方法每只雞采集20 mL抗凝血，3只雞的抗凝血混勻后分裝為15 mL離心管組、100 mL燒杯組、100 mL燒杯+等體積PBS 3組，每組分裝4份5 mL抗凝血，分別存放于4 ℃冰箱的同一層中，保存時長為72 h，其中在0、24、48和72 h時每組各取1份抗凝血，按照1.4操作方法制備1%紅細胞懸液，同一時間點制備的1%紅細胞懸液在同一塊血凝反應板中進行HA試驗，其中15 mL離心管組和100 mL燒杯組各進行3個重復操作，100 mL燒杯+等體積PBS組進行2個重復操作；上述每個時間點均從-80 ℃取出1份凍存的尿囊液作為抗原；本次試驗稀釋液選取PBS。

1.6 存放時長對1%紅細胞懸液的影響

根據(jù)抗凝血在不同容器內(nèi)放置不同時間，選擇對HA效價結(jié)果影響最小的容器制備80 mL 1% 紅細胞懸液，將其分成4等份，并置于4 ℃冰箱的同一層隔板上，保存時長為72 h。分別于0、24、48、72 h時各取1份進行HA試驗，每個時間點進行3個重復操作；每個時間點操作前從-80 ℃取出1份凍存的尿囊液作為抗原，本次試驗稀釋液選取PBS。

1.7 保存溫度和凍融次數(shù)對抗原的影響

1.7.1 保存溫度對抗原的影響

同時從-80 ℃取出8支NDV LaSota尿囊液，分為室溫和4 ℃ 2 組，每組4支尿囊液；每組分別于0、24、48、72 h時各取1支尿囊液進行HA試驗。同一時間點尿囊液在同一塊血凝反應板中進行HA試驗，并進行3個重復操作。本次試驗稀釋液選取PBS；1%紅細胞懸液按照1.4方法新鮮制備。

1.7.2 凍融次數(shù)對抗原的影響

從-80 ℃同時取出4支NDV LaSota尿囊液，分別于室溫和-80 ℃反復自然解融1、2、3和4次，HA試驗前從冰箱取出1支尿囊液和上述4支尿囊液同時進行HA試驗，相應的凍融次數(shù)依次為1、2、3、4、5次，每份尿囊液進行3個重復操作。本次試驗稀釋液選取PBS，本次試驗使用同一份新鮮制備的1%紅細胞懸液。

1.8 稀釋液的種類對HA效價的影響

將新鮮采集的60 mL混合抗凝血中，分裝于8個100 mL燒杯，5 mL/燒杯，將其分為0.9%氯化鈉和PBS 2 組，每組4個燒杯；分別置于冰箱4 ℃的同一層，保存時長為72 h，每組分別0、24、48和72 h各取1份抗凝血制備1%紅細胞懸液，1%紅細胞的制備以及相應的HA試驗均采用同組別的稀釋液。每個時間點均從-80 ℃取出1份凍存的尿囊液作為抗原，在同一塊血凝反應板中進行HA試驗，并進行3個重復。此外為了延長1%紅細胞懸液保存時間，采用0.75%氯化鈉加2%葡萄糖作為稀釋液，研究48 h內(nèi)HA效價的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 存放容器種類對抗凝血的影響

抗凝血在15 mL離心管組中上清逐漸由蠟黃色向淡黃色變化，0 h后紅細胞逐漸沉降至離心管底部，白細胞于24 h懸浮于紅細胞表面并形成一層白細胞膜，72 h后仍懸浮于紅細胞表面。100 mL燒杯組中抗凝血上清清澈透明，0 h后紅細胞逐漸沉降至燒杯底部，24 h時白細胞大量懸浮于紅細胞表面，48 h后白細胞逐漸消失，72 h后白細胞肉眼不可見，出現(xiàn)少量血凝絲，血凝絲由存放時間的延長而增多。100 mL燒杯+等量PBS組抗凝血上清清澈透明，從0 h開始紅細胞逐漸沉降至燒杯底部，24 h白細胞呈點線狀少量懸浮于紅細胞表面。于每個時間點分別取5 mL抗凝血制備1%紅細胞懸液，進行HA試驗，結(jié)果見表1。

表1 5 mL抗凝血在不同容器內(nèi)對HA效價的動態(tài)變化(log2)

組別0 h24 h48 h72 h96 h120 h15 mL離心管8875--100 mL燒杯888888100 mL燒杯+等體積PBS8876--

注：“-”表示因溶血嚴重未進行HA試驗。

由表1可知，在4 ℃存放條件下，抗凝血存放0和24 h時，3個試驗組的抗凝血制備的1%紅細胞懸液，測定的同一份抗原HA效價均為8log2；在24 h之后，15 mL離心管組和100 mL燒杯+等量PBS組內(nèi)的抗凝血所檢測的HA效價開始不斷下降，72 h后差異顯著。3組中100 mL燒杯組的結(jié)果是最穩(wěn)定的。

2.2 存放時長對1%紅細胞懸液的影響

1%紅細胞懸液在4 ℃保存條件下，于24 h時出現(xiàn)微溶血，48～72 h 1%紅細胞懸液溶血情況較24 h嚴重，相應地48～72 h的血凝反應板檢測孔內(nèi)的紅細胞也是呈現(xiàn)出溶血現(xiàn)象，存放時長對1%紅細胞懸液的影響的具體結(jié)果如圖1所示。

圖1 1%雞紅細胞懸液于4 ℃存放時HA效價的動態(tài)變化

2.3 保存溫度對抗原的影響

NDV LaSota尿囊液對溫度非常敏感，在室溫20～25 ℃條件下，0～24 h、24～48 h間NDV LaSota尿囊液均下降1個滴度，48 h后趨于穩(wěn)定；NDV LaSota尿囊液在4 ℃條件下，0～72 h均比較穩(wěn)定(見圖2)。

圖2 不同保存溫度對LaSota尿囊液HA效價的動態(tài)影響

2.4 凍融次數(shù)對抗原的影響

NDV LaSota尿囊液在-80 ℃保存條件下，每凍融2次，下降1個血凝滴度，結(jié)果見圖3。

圖3 凍融次數(shù)對LaSota HA 效價的影響

2.5 稀釋液的種類對HA效價的影響

使用稀釋液0.9%氯化鈉和PBS制備的1%紅細胞懸液，在4 ℃存放72 h，其影響HA效價的動態(tài)變化如圖4所示。PBS 緩沖能力優(yōu)于0.9% 氯化鈉，0.9% 氯化鈉組與PBS組相比普遍低1個滴度。HA 試驗中所用的稀釋液優(yōu)先選擇 PBS。此外，0.75% 氯化鈉加2% 葡萄糖作為稀釋液，制備1%紅細胞懸液并進行 HA 試驗發(fā)現(xiàn)，此稀釋液能夠有效延長1% 紅細胞懸液的保存時間，在48 h內(nèi)檢測到 LaSota 尿囊液 HA 效價均為9log2。

圖4 2種稀釋液對HA效價的動態(tài)影響

3 討論

當紅細胞處于一種非生理性模式時，在該模式的機械壓力或者高溫、低溫等情況下，紅細胞會發(fā)生細胞損失，常見的損傷表現(xiàn)為立即或者延遲性“溶血”，也有可能會發(fā)生“亞致死性損傷”[12]。溶血會導致紅細胞破碎、有效紅細胞數(shù)量減少、紅細胞比容降低，直接影響 NDV 的血凝素與紅細胞的有效凝集；同時紅細胞滲透脆性值不斷增大，隨著保存時間的不斷延長，紅細胞破壞加劇，溶血率顯著增加[13]。試驗結(jié)果表明未稀釋的抗凝血存放于較大容器內(nèi)于4 ℃ 保存的時間更長，液體高度低會減少機械壓力，同時促使溶液中含氧量增多，亦有助于維持全血中的血小板數(shù)量、充分發(fā)揮白細胞吞噬細菌的功能及優(yōu)化制備細胞懸液等優(yōu)點[14-15]。因此在不影響試驗的情況下1% 紅細胞懸液應現(xiàn)配現(xiàn)用。凍融次數(shù)是影響 NDV LaSota 尿囊液的關(guān)鍵因素，其凍融次數(shù)會嚴重影響 HA 效價， 建議NDV LaSota尿囊液凍融次數(shù)不超過2 次。稀釋液對于 HA 效價影響較大，試驗結(jié)果表明 PBS 的緩沖效果略優(yōu)于0.9% 的氯化鈉溶液。由于哺乳類動物需用生理鹽水濃度是0.9%，而禽類需用的生理鹽水濃度是0.75%，在后續(xù)試驗中亦比較了兩者的優(yōu)劣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.75% 氯化鈉濃度的緩沖效果更佳，與 PBS 效果相當。研究表明適當濃度的氯化鈉和葡萄糖不會引起紅細胞的溶血[16]。本試驗研究亦發(fā)現(xiàn)含2% 葡萄糖的0.75% 氯化鈉溶液可以維持 HA 效價為9log2 時長達48 h。通過研究發(fā)現(xiàn)影響HA試驗的因素比較多，除了操作技巧要熟練外，還需選擇最優(yōu)條件進行，這樣才能獲得更準確可靠的結(jié)果。