蘇倩，白麗艷，孫柯，林洋，呼和巴特爾，王文龍

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

布氏桿菌(Brucella)是一種細胞內(nèi)寄生革蘭陰性球桿菌[1]。布氏桿菌屬包括新發(fā)現(xiàn)的海洋哺乳動物種在內(nèi)，有7個種，21個生物型[2]。布氏桿菌易感染牛、羊、豬、犬等動物，而駱駝、鹿等動物也可感染，可通過接觸感染動物、食用未經(jīng)加工的乳制品或其他被污染的動物產(chǎn)品以及實驗室接觸傳播給人類，是一種全球范圍內(nèi)重大的人畜共患病，能引起人和多種動物的急性和慢性感染，被感染的人和動物表現(xiàn)為流產(chǎn)及不孕不育等癥狀[3]。該病的傳播和流行既給畜牧業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失，也給人的生命安全帶來了極大威脅。目前布氏桿菌S2疫苗是我國應用最多的疫苗[4]。S2疫苗具有較低的殘留毒力、較低的生產(chǎn)成本和相對容易的口服免疫，并且通過口服不會引起母畜的流產(chǎn)[5]。因此，自1971年以來，它在我國廣泛應用于奶牛、山羊、綿羊和豬的免疫接種，在布氏桿菌病的防控過程中發(fā)揮了重要的作用[6]。但在使用的過程中，也出現(xiàn)了新的問題，如常用的診斷方法，無法區(qū)分疫苗免疫和自然感染動物，使得我國普遍采用的檢疫淘汰和免疫結(jié)合的防治措施無法有效實施，不能在免疫羊群中徹底將患病動物檢出，達到凈化畜群的目的。為此，本研究在實驗室前期工作的基礎上[7-8]，篩選出S2JY3基因，并運用NCBI中BLAST對S2JY3基因進行比對，發(fā)現(xiàn)S2JY3基因為布氏桿菌S2弱毒疫苗特有基因，對其進行生物信息學分析、克隆測序、原核表達和免疫原性驗證，試驗結(jié)果可為布氏桿菌病自然感染和疫苗接種免疫的鑒別診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

布氏桿菌S2弱毒疫苗購自金宇保靈生物藥品有限公司；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；克隆載體pMD19-T Simple Vector購自大連寶生物有限公司；表達載體pET30a(+)本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑

DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司；DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ和SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購自北京索萊寶公司；T4 DNA連接酶和蛋白質(zhì)Marker購自大連寶生物公司；驢抗綿羊IgG-HRP購自北京依托生物有限公司；試驗所用血清由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院實驗室采集保存。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的擴增

將布氏桿菌S2弱毒疫苗(水浴鍋中85 ℃滅活1 h)，按照Axygen公司DNA提取試劑盒操作步驟進行基因組DNA提取。參照布氏桿菌S2弱毒疫苗全基因組測序數(shù)據(jù)中S2JY3基因序列設計引物，并分別在引物中引入酶切位點，上、下游引物序列見表1(劃線處為EcoR Ⅰ、XhoⅠ酶切位點)，由北京華大基因有限公司合成。目的基因PCR擴增反應體系為25 μL：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 45 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 S2JY3基因引物設計

1.2.2 pET30a-S2JY3的構(gòu)建

S2JY3基因PCR產(chǎn)物進行膠回收，在3′端添加“A-尾”后，連接克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，將測序正確的重組克隆菌和pET30a(+)空載體的菌株提取質(zhì)粒后，分別用限制酶EcoR Ⅰ、XhoⅠ進行雙酶切，回收產(chǎn)物。將回收的目的基因DNA片段與表達載體pET30a(+)進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，180 r/min培養(yǎng)2 h后，將重組菌涂布于含卡那霉素(Kan)的固體LB培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜。待菌落生長后，以接種針挑取單個菌落，接種到含Kan的液體LB培養(yǎng)基里，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h，取菌液進行PCR鑒定、雙酶切鑒定后，選取陽性菌株送華大基因有限公司進行雙向測序。

1.2.3 重組表達菌誘導表達及Western blot檢測

用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)對重組表達菌BL21(pET30a-S2JY3)進行誘導表達，收集菌體，用PBS 洗滌3次，加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，室溫靜置1～2 h，經(jīng)-20 ℃反復凍融3次之后超聲波破碎菌體。分別收集上清和沉淀，用SDS-PAGE檢測重組蛋白表達形式后，進行重組蛋白純化。分別以鼠抗His-tag IgG、S2疫苗免疫羊血清、布氏桿菌自然感染羊血清為一抗，羊抗鼠IgG-HRP、驢抗綿羊IgG-HRP為二抗對重組蛋白進行Western blot檢測。

1.2.4 S2JY3基因生物信息學分析

使用DNAStar將S2JY3基因翻譯成氨基酸序列，應用在線軟件ExPASy-Prot Param分析S2JY3基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列組成及理化性質(zhì)；ProtScale軟件分析該蛋白的氨基酸殘基的親疏水性； TMHMM軟件進行跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預測；SignaIP 4.1在線軟件進行信號肽分析[9]；SOPMA在線軟件分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL預測基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)[10-11]；DNAStar中的Protean軟件預測細胞抗原表位等。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴增

PCR擴增后，產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示(圖1)，擴增出大小約1 257 bp的條帶，與S2JY3基因預期大小一致。

M.DL2000 DNA Marker；1～3. S2JY3基因PCR產(chǎn)物；4. 空白對照

圖1 S2JY3基因PCR產(chǎn)物擴增結(jié)果

2.2 pET30a(+)-S2JY3重組質(zhì)粒的鑒定

對重組克隆菌進行質(zhì)粒雙酶切鑒定，結(jié)果見圖2，基因片段大小與預期相符。陽性菌株測序結(jié)果與基因組測序數(shù)據(jù)中S2JY3基因序列進行比對，兩者序列完全一致。

M1. DL2000 DNA Marker；1～3. 重組克隆質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物；M2. DL500 DNA Marker

圖2 S2JY3基因重組克隆質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 重組表達菌Western blot檢測

重組表達菌BL21(pET30a-S2JY3)由IPTG誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE檢測后，分別以鼠抗His-tag IgG、S2疫苗免疫羊血清、布氏桿菌自然感染羊血清為一抗，對重組蛋白進行Western blot檢測，結(jié)果見圖3，重組蛋白與鼠抗His-tag IgG、S2疫苗免疫羊血清均發(fā)生了結(jié)合反應，而與布氏桿菌自然感染羊血清未發(fā)生反應。

M.蛋白Marker；1. His-tag抗體檢測；2. S2疫苗免疫血清檢測；3. 自然感染血清檢測

圖3 重組蛋白Western blot檢測

2.4 S2JY3基因編碼產(chǎn)物的生物信息學分析

2.4.1 S2JY3蛋白理化性質(zhì)分析

將S2JY3基因序列用DNAStar中EditSeq軟件翻譯為氨基酸序列后，經(jīng)ExPASy-Prot Param分析發(fā)現(xiàn)S2JY3基因編碼蛋白含有418個氨基酸，大小為43 kDa，分子式為C2138H3423N619O613S15，原子總數(shù)是6 808個，相對分子質(zhì)量為48 088.38，理論PI值為9.73。該蛋白由20種氨基酸組成，其中精氨酸(Arg)(R)含量最高為9.8%，半胱氨酸(Cys)(C)含量最低為0.5%；帶負電荷殘基天冬氨酸和谷氨酸(Asp+Glu) 53個，帶正電荷殘基精氨酸和賴氨酸(Arg+Lys) 72個；當N端的1個氨基酸為纈氨酸(Val)時，S2JY3蛋白在體外哺乳動物網(wǎng)狀紅細胞中的半衰期為100 h，在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，在大腸埃希菌體內(nèi)的半衰期大于10 h。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為36.31，表明是穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為79.88；總平均親水性為-0.577，為親水性蛋白。

2.4.2 S2JY3蛋白親疏水性分析

用ProtScale在線軟件對S2JY3蛋白進行親疏水性進行分析，結(jié)果見圖4，S2JY3蛋白是親水性蛋白，其親水性在249位點有最大值2.056，在280、281位點均有最小值-3.111，與ExPASy-Prot Param結(jié)果一致。

圖4 S2JY3蛋白親疏水性分析

2.4.3 S2JY3蛋白跨膜區(qū)和信號肽預測

用TMHMM預測跨膜區(qū)，S2JY3基因編碼蛋白無跨膜區(qū)，全部在膜外，見圖5。經(jīng)SignalP軟件預測該蛋白的信號肽，見圖6，通過分析發(fā)現(xiàn)S2JY3編碼產(chǎn)物不存在信號肽。

圖5 S2JY3基因編碼產(chǎn)物跨膜結(jié)構(gòu)預測

圖6 S2JY3基因編碼產(chǎn)物信號肽預測

2.4.4 S2JY3蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

應用SOPMA程序預測S2JY3基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)，S2JY3基因編碼蛋白總長度為418個氨基酸，其中參與α螺旋形成的氨基酸有248個，占59.33%；參與形成延伸鏈的氨基酸有32個，占7.66%；參與形成β轉(zhuǎn)角的氨基酸有23個，占5.50%；參與形成無規(guī)則卷曲的氨基酸有115個，占27.51%。

2.4.5 蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

S2JY3基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組合形成復雜的三級結(jié)構(gòu)。

2.4.6 蛋白抗原表位預測

抗原表位由DNAStar中的Protean軟件預測可知該蛋白約有15個潛在B細胞抗原表位位點，分別在8～41、54～73、79～93、95～114、126～154、157～165、167～176、191～225、232～245、253～263、275～287、305～322、337～357、364～398、404～419位氨基酸殘基附近。有21個潛在T細胞抗原表位位點，分別在2～5、7～10、20～22、31～34、110～141、152～158、161～170、189～212、226～240、242～246、257～260、266～269、271～273、293～306、326～332、336～339、343～348、353～358、369～373、382～387、396～412位氨基酸殘基附近。

3 討論

布氏桿菌病在全球范圍內(nèi)流行，近幾年，我國的布氏桿菌病疫情有上升的趨勢[12]。眾所周知，布氏桿菌為胞內(nèi)寄生菌，協(xié)助其進入細胞并感染細胞依靠的毒力因子有很多種，例如Sidhu-Muoz等[13]提到的5種必需的毒力因子：virB操縱子(virB)編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion systems, T4SS)、環(huán)狀β-葡聚糖、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(BvrS/BvrR)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)以及病原相關分子模式(PAMPs)。這些毒力因子有助于巨噬細胞中病原體的存活和復制，布氏桿菌的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運和識別宿主防御的能力等[14]。布氏桿菌為了適應生存環(huán)境，逐漸的進化出一系列機制，如抑制細胞凋亡和通過其microRNA影響免疫應答等調(diào)節(jié)方式來逃避宿主早期的先天性和適應性免疫應答[15]。因此，該病主要以預防和控制為基礎，疫苗的免疫接種在綜合防治措施中發(fā)揮著重要作用。但現(xiàn)有的疫苗均有一定的缺陷，常用的診斷方法無法鑒別出疫苗免疫和自然感染，對種群凈化方面帶來一定的難度，亟需深入研究布氏桿菌病的發(fā)病機制、檢測方法和防控措施等。

本試驗以布氏桿菌S2弱毒疫苗特有的S2JY3基因為研究對象，成功構(gòu)建重組表達蛋白rS2JY3，并進行Western blot鑒定，結(jié)果rS2JY3與布氏桿菌S2疫苗免疫綿羊血清發(fā)生特異性結(jié)合反應，與自然感染綿羊血清無反應，表明rS2JY3具有良好的抗原性和特異性。

在短短十多年時間里，生物信息學在信息技術(shù)和分子生物學理論的基礎上迅速發(fā)展，成為用來處理和理解生命系統(tǒng)中不斷增加的數(shù)據(jù)量的日常工具[16-17]。生物信息學技術(shù)在蛋白質(zhì)、DNA、RNA及其復合物的三維結(jié)構(gòu)等領域應用廣泛，其預測結(jié)果有效的減少了試驗的盲目性[18]。本試驗利用其技術(shù)，對重組蛋白rS2JY3進行預測，該蛋白大小為43 kDa，理論PI值為9.73，由20種氨基酸組成，其中Arg(R)含量最高為9.8%，Cys(C)含量最低為0.5%；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為36.31，表明是穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)為79.88；總平均親水性為-0.577，為親水性蛋白。重組蛋白rS2JY3全部位于膜外，不存在信號肽。二級結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示參與α螺旋形成的氨基酸有248個，占59.33%；參與形成延伸鏈的氨基酸有32個，占7.66%；參與形成β轉(zhuǎn)角的氨基酸有23個，占5.50%；參與形成無規(guī)則卷曲的氨基酸有115個，占27.51%。

綜上，本試驗成功構(gòu)建原核表達蛋白rS2JY3，生物信息學分析表明該蛋白具有較多的B細胞抗原表位和T細胞抗原表位，易于被識別和促發(fā)免疫反應。研究結(jié)果為S2JY3蛋白的免疫學特性研究、S2疫苗的深入研究中提供有效理論基礎，同時也為布氏桿菌病疫苗免疫和自然感染鑒定方法的建立提供可靠的依據(jù)。