邢玉娟，莊彩云，王建國，邱樹磊，劉運(yùn)鎮(zhèn)，陳玉庫*，楊帆，劉益，曹希敏

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2. 內(nèi)蒙包頭市九原區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 包頭 014060；3. 山東省威海市環(huán)翠區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 威海 264200)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一種急性、熱性、傳染性疾病，臨床上以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為特征[1]。不同年齡、性別、品種的犬均可感染，病死率高，是危害養(yǎng)犬業(yè)的主要疫病之一。目前對于犬細(xì)小病毒感染的治療，對出血性腸炎型病例主要采用緊急注射高免血清或免疫球蛋白、抗病毒、防止繼發(fā)感染、對癥治療和支持療法等綜合措施，而對非化膿性心肌炎型病例采用上述治療措施收效甚微[2-3]。為了研制和開發(fā)治療犬細(xì)小病毒感染的中藥處方，并探討其抗病毒作用機(jī)理，本試驗(yàn)以小鼠為模型觀察了中藥苦芪超微粉對環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率和免疫器官指數(shù)變化，在此基礎(chǔ)上在犬體內(nèi)研究了該藥對犬細(xì)小病毒感染的保護(hù)作用，為進(jìn)一步擴(kuò)大臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

苦芪超微粉，由黃芪、苦參、梔子、甘草4味中藥按4∶3∶2∶1比例組成，由河南省康星藥業(yè)股份有限公司試制。使用時(shí)用雙蒸水配制成500 mg/mL的混懸液。

黃芪多糖口服液，北京生泰爾生物科技有限公司生產(chǎn)，批號1608191。

環(huán)磷酰胺注射液，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)，批號H32020857。

1.2 主要試劑

小牛血清，杭州四季青生物制品廠產(chǎn)品；RPMI 1640培養(yǎng)液，Gibco公司產(chǎn)品；伴刀豆素球蛋白(ConA)，上海浩然生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)溶液，Amresco公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞分離液，上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；淋巴細(xì)胞裂解液，二甲亞砜(DMSO)，分析純，蘇州正興化工研究院產(chǎn)品；犬細(xì)小病毒(CPV)檢測板，上海容暉生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級昆明小鼠60只，體重(18±2)g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號為SCXK(蘇)2013-0005)。

田園犬，60只，42～48 日齡，未接種疫苗，CPV 檢測板檢測呈陰性，委托江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房采購，注射左旋咪唑驅(qū)蟲，隔離飼養(yǎng)觀察7 d。

1.4 苦芪超微粉對免疫抑制小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及免疫器官指數(shù)的影響

1.4.1 對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

取昆明小鼠60只，隨機(jī)分為6組，即苦芪超微粉高、中、低劑量組(40，20，10 mL/kg)、藥物對照組(黃芪多糖口服液，10 mL/kg)、模型組和空白對照組，每組10 只。1～4組每天灌胃給藥1次，模型組和空白對照組灌胃給予與藥物對照組等劑量生理鹽水。連續(xù)5 d后，1～5 組腹腔注射環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)，空白對照組腹腔注射生理鹽水(40 mg/kg)，連續(xù)2 d，末次注射給藥后，脫頸椎處死小鼠，無菌取脾臟、胸腺，稱重。稱重后將脾用滅菌生理鹽水沖洗3 次，放入含Hank’s液的平皿中剪碎，裝入200 目網(wǎng)孔的尼龍網(wǎng)袋中，用彎針頭擠壓過濾，收集細(xì)胞液，加入淋巴細(xì)胞分離液，2 000 r/min離心20 min，吸取中間云霧狀白細(xì)胞層，用Hank’s液洗2 次，用RPMI 1640營養(yǎng)液稀釋成1×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液。將脾淋巴細(xì)胞懸液按照小鼠灌胃給藥的分組加入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，每組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，4個(gè)孔加入ConA(終濃度為0.325 μg/mL)，另外4個(gè)孔加同體積的空白培養(yǎng)基。

將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于5% CO2、39.5 ℃培養(yǎng)箱中72 h，每孔加入20 μL MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，每孔吸出上清液，加入100 μL裂解液，在微量震蕩器上混勻使其顏色變澄清，用酶聯(lián)免疫儀檢測570 nm下的A570值，按照以下公式計(jì)算A570差值，作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)[4]。ΔA570為ConA 誘導(dǎo)孔A570均值與無 ConA 誘導(dǎo)孔A570均值的差。

1.4.2 對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

末次注射環(huán)磷酰胺給藥后，脫頸椎處死小鼠，稱取小鼠體重；取胸腺和脾臟，稱取濕重，并計(jì)算脾指數(shù)和胸腺指數(shù)。 免疫器官指數(shù)=免疫器官重量/體重×100%。

1.5 苦芪超微粉治療犬細(xì)小病毒感染的效果觀察

1.5.1 動(dòng)物分組及處理

利用2只患有犬細(xì)小病毒病的犬進(jìn)行水平感染[5]，將自然發(fā)病且 CPV 檢測板檢測呈陽性的53只病犬隨機(jī)分為 5組(取其中50只，另外3只另法治療)，另取3只同日齡飼養(yǎng)的健康犬作為空白對照，隔離飼養(yǎng)。造模后第4 天開始給藥。中藥給藥劑量參考文獻(xiàn)[6]，2 kg田園犬(50日齡)給藥劑量相當(dāng)于小鼠的2.46倍。

整個(gè)試驗(yàn)過程中，中藥治療組和藥物對照組每天每只病犬補(bǔ)充乳酸鈉林格注射液500 mL、5%葡萄糖生理鹽水250 mL、鹽酸消旋山莨菪堿液(654-2)0.5 g、維生素C注射液5 mL、能量合劑10 mL，作為基礎(chǔ)治療，給予清潔而足夠的冷淡鹽水。見表 1。

表1 動(dòng)物分組及處理

項(xiàng)目組別空白對照苦芪高劑量苦芪中劑量苦芪低劑量藥物對照模型犬?dāng)?shù)量31010101010給藥方案口服生理鹽水,每只2 mL,每天2次,連用5 d口服受試藥物,每只4 mL,每天2次,連用5 d+基礎(chǔ)治療口服受試藥物,每只2 mL,每天2次,連用5 d+基礎(chǔ)治療口服受試藥物,每只1 mL,每天2次,連用5 d+基礎(chǔ)治療口服黃芪多糖口服液,每只2 mL,每天2次,連用5 d+基礎(chǔ)治療不給藥

1.5.2 觀察指標(biāo)

癥狀觀察：每天觀察記錄犬的發(fā)病情況，包括嘔吐、拉稀、精神狀態(tài)、體溫等。

死亡率：每天記錄各組死亡數(shù)，觀察至用藥停止后7 d，統(tǒng)計(jì)各組死亡率。

治愈率：凡在試驗(yàn)期間，經(jīng)給藥后嘔吐、下痢、便血停止，體溫、精神狀況及食欲恢復(fù)正常，治療結(jié)束后觀察7 d無異常者，判為治愈，根據(jù)治愈犬占整組試驗(yàn)犬比例計(jì)算治愈率。

有效率：用藥停止后7 d體征大有好轉(zhuǎn)，即體溫、精神、食欲恢復(fù)正常，但糞便尚未成形，或體溫、精神恢復(fù)正常，但食欲不振和糞便未成形等，判為有效，根據(jù)有效犬占整組試驗(yàn)犬比例計(jì)算有效率。

無效率：用藥后體征無改善或惡化、死亡者，判為無效?；蝮w溫未降至正常，食欲時(shí)好時(shí)壞，糞便帶有血絲或黏液者，判為無效[7]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，淋巴細(xì)胞A570值、免疫器官指數(shù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 對ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

與空白對照組相比，模型組小鼠脾淋巴細(xì)胞的A570值顯著降低(P<0.05)，說明環(huán)磷酰胺造模成功；與模型組比較，苦芪超微粉高、中、低劑量組和藥物對照組的A570值顯著升高(P<0.05)。高劑量組A570值顯著高于低劑量組(P<0.05)，中劑量組A570值也高于低劑量組，但差異不顯著(P>0.05)。見表2。

表2 苦芪超微粉對脾淋巴細(xì)胞增殖的影響

組別劑量/(mL·kg-1)ΔA570值空白對照-0.166±0.022a苦芪超微粉高劑量400.168±0.011a苦芪超微粉中劑量200.162±0.009ab苦芪超微粉低劑量100.149±0.012b藥物對照-0.161±0.012ab模型組-0.091±0.023c

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.2 對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

模型組小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均降低，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)，表明造模成功。胸腺指數(shù)，與模型組相比，苦芪超微粉高、中、低劑量組和藥物對照組有顯著差異(P<0.05)；脾指數(shù)，與模型組相比，苦芪超微粉高、中劑量組和藥物對照組有顯著差異(P<0.05)，苦芪超微粉低劑量組脾指數(shù)高于模型組，但差異不顯著(P>0.05)。見表3。

表3 苦芪超微粉對免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響

組別劑量/(mL·kg-1)胸腺指數(shù)脾指數(shù)空白對照-2.16±0.57a3.62±0.40a苦芪超微粉高劑量402.09±0.26a3.38±0.34ab苦芪超微粉中劑量202.06±0.41a3.26±0.61ab苦芪超微粉低劑量101.90±0.24a2.94±0.38bc藥物對照-2.07±0.20a3.40±0.33ab模型-1.40±0.37b2.53±0.29c

2.3 苦芪超微粉治療犬細(xì)小病毒感染的效果

2.3.1 造模情況

用細(xì)小病毒感染犬進(jìn)行水平感染后，第 1～2天未出現(xiàn)明顯癥狀，第3天起，病犬食欲減退，第 4天出現(xiàn)嘔吐與拉稀癥狀，嘔吐物呈白色泡沫狀，部分犬伴有腹瀉，糞便帶有黏液或血絲，氣味腥臭，取肛拭子用 CPV 檢測板檢測為陽性?？瞻讓φ战M犬只精神狀態(tài)良好，食欲正常，大小便正常。

2.3.2 各組用藥效果觀察

苦芪超微粉治療組試驗(yàn)犬用藥3 d后，高劑量組中，嘔吐物為白色黏液，雖有拉稀但沒有血便出現(xiàn)。用藥5 d后，有7只犬嘔吐次數(shù)減少，排便次數(shù)減少，食欲逐漸恢復(fù)，用藥停止后第3天，嘔吐和拉稀均得到控制且食欲恢復(fù)，精神良好。另3只犬中，1只犬在用藥停止后第7天康復(fù)，另2只糞便雖成形、無黏液，但體溫稍高，食欲時(shí)好時(shí)壞，判為無效；中劑量組在用藥停止后第7天，8只犬痊愈，另2只病犬食欲尚可，但糞便不成形，體溫稍高，判為無效；低劑量組用藥5 d后，仍有1只犬有血便，用藥停止后第4天，衰竭死亡。其余9只病犬在用藥停止后第7天，7只食欲逐漸恢復(fù)，另2只糞便較稀軟，體溫未恢復(fù)正常，判為無效。

藥物對照組試驗(yàn)犬用藥3 d后，有3只犬出現(xiàn)血便。用藥5 d后嘔吐次數(shù)減少，血便次數(shù)由3次減少到 2 次。用藥停止后第2天，死亡1只，另2只在結(jié)束觀察前糞便仍帶有血絲和黏液，判為無效。見表4。

模型組試驗(yàn)犬在用藥停止后第1天有6只排深色血便，嘔吐物為白色黏液，被毛粗亂無光澤，精神高度沉郁。用藥停止后第3天10只犬均出現(xiàn)血便，嘔吐次數(shù)由 3～4 次增加到 6～7 次，眼窩凹陷，皮膚彈性減退，精神高度沉郁，臥地不起。用藥停止后第4天晚上死亡2只，第5天上午死亡1只，第6天上午死亡1只，第7天上午死亡3只，死亡之前，病犬四肢冰涼，身體蜷縮顫抖，被毛粗亂，體溫下降。另3只中，2只在結(jié)束觀察前仍高度衰竭，瀕臨死亡，另1只精神好轉(zhuǎn)。見表4。

表4 各組有效率、治愈率和死亡率

組別數(shù)量有效數(shù)有效率/%治愈數(shù)治愈率/%死亡數(shù)死亡率/%空白對照3----00苦芪高劑量1088088000苦芪中劑量1088088000苦芪低劑量10770770110藥物對照10770770110模型10----770

3 討論

3.1 苦芪超微粉對淋巴細(xì)胞增殖的影響

淋巴細(xì)胞增殖是反映機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)。淋巴細(xì)胞的增殖數(shù)量，決定了機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)度[8]。本試驗(yàn)中，苦芪超微粉高、中、低劑量組的A570值顯著高于模型組，說明苦芪超微粉能夠促進(jìn)免疫抑制小鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖，對環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的具有免疫增強(qiáng)作用。高劑量組的效果優(yōu)于中、低劑量組，提示苦芪超微粉對小鼠特異性免疫功能具有較好的調(diào)節(jié)作用，且具有一定的量效關(guān)系。陳星星等[9]研究用不同濃度的鐵皮石斛對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制模型小鼠脾臟淋巴細(xì)胞體外增殖的影響，也取得了相似的結(jié)果，在一定濃度范圍內(nèi)，隨鐵皮石斛濃度的增高，細(xì)胞分裂增殖效果有增加趨勢。

3.2 苦芪超微粉對機(jī)體免疫器官指數(shù)的影響

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的淋巴器官，且胸腺是機(jī)體的中樞免疫器官，兩者的功能與機(jī)體免疫狀況密切相關(guān)。免疫器官指數(shù)是衡量機(jī)體免疫狀態(tài)的初步指標(biāo)[10]。在本試驗(yàn)中，注射環(huán)磷酰胺小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)均顯著低于正常小鼠，灌服苦芪超微粉后提高了免疫抑制小鼠的免疫器官指數(shù)，其中高、中劑量組的效果較好，與模型組相比較差異顯著，但胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均未能恢復(fù)到空白對照組小鼠的水平。提示苦芪超微粉能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺所致的小鼠的免疫器官指數(shù)的下降，維持機(jī)體非特異性免疫功能。一些研究證明，中藥車前草粗多糖能提高環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠血清中溶血素水平，且對脾臟與胸腺萎縮有緩解作用，與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致[11-13]。

3.3 苦芪超微粉對犬細(xì)小病毒感染的治療作用

現(xiàn)代研究證明，黃芪主含黃芪多糖、維生素以及多種微量元素等，具有增強(qiáng)免疫和抗病毒作用，苦參主含苦參堿和氧化苦參堿，具有廣譜抗病毒作用，梔子主含環(huán)烯醚萜類、梔子苷等，具有保肝利膽、抗炎、抗氧化、促進(jìn)胰腺分泌及胃功能保護(hù)等作用[14]。腸炎型犬細(xì)小病毒感染，主要表現(xiàn)嘔吐、腹瀉、便血、脫水、電解質(zhì)紊亂等癥狀，治療時(shí)除抗病毒、防止電解質(zhì)紊亂、補(bǔ)液強(qiáng)心、對癥治療外，仍需防止繼發(fā)細(xì)菌感染。方中黃芪增強(qiáng)免疫，并與苦參協(xié)同抗病毒，而梔子等則主要起到抗炎和恢復(fù)機(jī)體胃腸功能的作用。

根據(jù)明代醫(yī)家吳又可的“雜氣”病因?qū)W說，犬細(xì)小病毒感染屬于“毒邪血痢”[15]。治宜補(bǔ)氣養(yǎng)血、清熱解毒、燥濕止痢?？嘬纬⒎塾牲S芪、苦參和梔子等組成，其中，黃芪性微溫味甘，入脾、肺經(jīng)，功能補(bǔ)氣固表，托毒生肌，利水退腫，主治脾肺氣虛、表虛汗出、瘡癰難潰、水腫；苦參性寒味苦，入心、肝、胃、大腸、膀胱經(jīng)，功能清熱燥濕，祛風(fēng)殺蟲，利尿，主治濕熱黃疸、瀉痢、疥癬；梔子性寒味苦，入心、肝、肺、胃經(jīng)，功能清熱瀉火，涼血解毒，主治目赤腫痛、濕熱黃疸、熱淋、尿血、衄血[14]。諸藥相合，共湊補(bǔ)氣養(yǎng)血、清熱解毒、燥濕止痢之功。