展 凡，王玉涵， 王 萌，鄭 鳳，蘇婧婧，程 卉，李慶林

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心 新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230038)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中國常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居腫瘤中第3位[1]。手術(shù)切除、肝移植是HCC主要的治療方法[2]，但預(yù)后不良導(dǎo)致的HCC患者5年生存率低于5%[3]。越來越多的研究表明，自噬與HCC的危險(xiǎn)因素相關(guān)，如氧化應(yīng)激、代謝功能障礙、肝酒精紊亂和脂肪肝疾病[4-5]。細(xì)胞自噬是由基因調(diào)控并在進(jìn)化上保守的細(xì)胞內(nèi)降解通路。在自噬過程中，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，其可降解細(xì)胞質(zhì)中受損、變形的大分子物質(zhì)和細(xì)胞器，并將降解產(chǎn)物循環(huán)利用，從而為細(xì)胞的正常生存、代謝提供原料[6]。自噬作為抗腫瘤藥物治療的潛在作用靶點(diǎn)近年來已得到確認(rèn)。但中藥活性成分新藤黃酸(gambogenic acid，GNA)對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402自噬的影響尚不清楚。本研究通過體外試驗(yàn)，初步探討GNA抑制人肝癌細(xì)胞BEL-7402增殖的作用與自噬的關(guān)系。

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱：日本SANYO公司；潔凈工作臺(tái)(SW-CJ1F)：江蘇省蘇凈集團(tuán)；倒置顯微鏡(Olympus CKX41)和倒置熒光顯微鏡(Olympus BX51)：日本Olympus公司；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(SpectraMax M2e)：美國MD公司；滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司。

1.2 主要試劑和藥品 GNA：陜西省寶雞市辰光生物科技有限公司(純度98%，批號(hào)HN045248198)；RPMI 1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；氯喹(Chloroquine ，CQ)(貨號(hào)C6628)：Sigma公司；雷帕霉素(Rapamycin ，Rap)(貨號(hào)53123-88-9)：Sigma公司；阿霉素(貨號(hào) 25316-40-9)：Selleck公司；anti-beclin 1(批號(hào)3495T)、anti-LC3B(批號(hào)3868T)、anti-p62 (批號(hào)8025T)和anti-actin (批號(hào)3700T)：美國CST公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞活力和藥物敏感性檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按照5×103/mL接種于96孔板。設(shè)立空白對(duì)照組(0 μmol/L GNA)和不同濃度給藥組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁良好，棄培養(yǎng)基，每孔分別加入0、2、4、8、16 μmol/L的GNA溶液100 μL，放置37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱24、48、72 h后棄去培養(yǎng)基，在終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT培養(yǎng)液20 μL繼續(xù)孵育。孵育終止棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，搖床上避光振蕩10 min后用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測(cè)每孔的光密度(optical density，OD)值，按照上述過程，重復(fù)3次，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.2 單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色熒光顯微鏡觀察自噬體的形成 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔3×105個(gè)接種于6孔板，待細(xì)胞生長良好，按照實(shí)驗(yàn)要求分為空白對(duì)照組、Rap組(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)給藥組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集對(duì)照組和給藥組細(xì)胞，PBS洗2遍，用1 mL PBS重懸，加入1 μL MDC儲(chǔ)存液(濃度為50 mmol/L)，使MDC的終濃度為0.05 mmol/L。37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3遍。吸取微量細(xì)胞懸液滴于玻片，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡觀察自噬小體。

2.3 透射電子顯微鏡觀察自噬體水平 按照試驗(yàn)要求設(shè)立空白對(duì)照組、Rap組(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)給藥組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，離心使細(xì)胞沉淀成團(tuán)，將戊二醛沿著管壁緩慢加入用于固定細(xì)胞，放入4 ℃冰箱。次日用PBS洗滌細(xì)胞3遍，每次5 min；再用鋨酸于4 ℃固定1.5 h，PBS洗3次，每次5 min；按以下步驟脫水：50%乙醇10 min，70%乙醇10 min，90%乙醇10 min，100%乙醇10 min，100%丙酮10 min 2次；環(huán)氧樹脂包埋過夜；再放入45 ℃烘箱內(nèi)固化12 h；切片后用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

2.4 Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)、p62、beclin 1的表達(dá)情況 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按照每孔5×106個(gè)接種于6孔板，待細(xì)胞生長良好，按照試驗(yàn)要求分為空白對(duì)照組、Rap組(50 μmol/L)和GNA(1.5、3、6 μmol/L)給藥組以及CQ組(10 μmol/L)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。提取各組總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。蛋白上樣量定為20 μg。進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)至NC膜，在5%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h，棄封閉液并洗膜。加入對(duì)應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗，搖床慢搖2 h，洗膜后曝光處理。并計(jì)算目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白(β-actin)條帶灰度比值，以此來確定各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 結(jié)果

3.1 GNA對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402存活率的影響 不同濃度的GNA作用于BEL-7402細(xì)胞24、48、72 h后，BEL-7402細(xì)胞存活率隨時(shí)間和劑量依賴性降低，IC50分別為6.408、4.077、3.001 μmol/L。見圖1。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

3.2 GNA對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402形態(tài)的影響 空白對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞數(shù)目較多且排列緊密，胞質(zhì)均勻透明；Rap組細(xì)胞貼壁生長較少，細(xì)胞脫落、懸浮增加，形狀不一，細(xì)胞碎片化；不同濃度GNA組，隨藥物濃度增加，細(xì)胞貼壁數(shù)量減少，排列不緊密，細(xì)胞懸浮增加，高濃度GNA組出現(xiàn)細(xì)胞碎片化。見圖2。

注:A.空白對(duì)照組;B.Rap組;C.GNA1.5μmol/L組;D.GNA3μmol/L組;E.GNA6μmol/L組

圖2 倒置顯微鏡下觀察GNA對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402形態(tài)的影響(10×40倍)

3.3 GNA對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402自噬小體形成的影響 熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度較弱，自噬小體的數(shù)量較少；自噬誘導(dǎo)劑Rap組自噬小體數(shù)目較多；隨GNA濃度增加，熒光強(qiáng)度增加即自噬小體增多。見圖3。

注:A.空白對(duì)照組;B.Rap組;C.GNA1.5μmol/L組;D.GNA3μmol/L組;E.GNA6μmol/L組

圖3 GNA對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402細(xì)胞自噬小體形成的影響(MDC染色，10×40倍)

3.4 GNA對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402自噬小體水平的影響 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞自噬小體，空白對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，偶見少量自噬小泡；Rap組細(xì)胞漿中出現(xiàn)大量自噬空泡聚集；隨GNA濃度的增加，自噬泡數(shù)目增多，堆積明顯。圖中箭頭所指均為自噬小體。見圖4。

注:A.空白對(duì)照組;B.Rap組;C.GNA1.5μmol/L組;D.GNA3μmol/L組;E.GNA6μmol/L組

圖4 透射電子顯微鏡觀察GNA對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402自噬小體水平的影響(1×20 000倍)

3.5 GNA對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL-7402自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 不同濃度(1.5、3、6 μmol/L)GNA作用細(xì)胞24 h后，隨藥物濃度的增加，Beclin1、p62和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，LC3-Ⅰ蛋白水平無明顯變化；Rap組各自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)說明Rap可誘導(dǎo)人肝癌BEL-7402細(xì)胞發(fā)生自噬(見圖5Ⅰ)。單獨(dú)加入10 μmol/L CQ可降低Beclin1蛋白表達(dá)，增加LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)以及p62蛋白的積累，結(jié)果提示GNA對(duì)人肝癌BEL-7402細(xì)胞自噬的影響可能與其抑制自噬后期進(jìn)程有關(guān)(見圖5Ⅱ)。

注：A.空白對(duì)照組；B.Rap組；C.GNA 1.5 μmol/L組；D.GNA 3 μmol/L組；E.GNA 6 μmol/L組；F.10 μmol/L CQ組；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05

4 討論

近年來，自噬被認(rèn)為與癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞處于饑餓、化學(xué)治療、低氧等應(yīng)激情況時(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高，為腫瘤細(xì)胞生存提供必須的營養(yǎng)和能量，腫瘤細(xì)胞存活能力增強(qiáng)。越來越多的研究表明，中藥有效成分可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬水平來抵抗癌癥，增加癌癥治療的可能性[7-8]。

中藥藤黃系藤黃科植物分泌的干燥樹脂[9]，黃棕色，呈不規(guī)則塊狀。1984年呂歸寶從藤黃中分離得到GNA，其具有良好的抗腫瘤作用。近年來，本課題組對(duì)GNA的系列研究發(fā)現(xiàn)，GNA能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，其抗腫瘤作用與調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤細(xì)胞保護(hù)性自噬有關(guān)[10-14]。本研究表明，GNA在一定劑量范圍呈時(shí)間和劑量依賴性抑制BEL-7402細(xì)胞增殖。GNA處理后，MDC染色熒光顯微鏡觀察和透射電子顯微鏡觀察結(jié)果均顯示，細(xì)胞內(nèi)自噬小體堆積。同時(shí)，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，自噬上游蛋白Beclin1的表達(dá)增加，提示自噬被激活；LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變?cè)黾?，也提示自噬小體數(shù)量的增多。但是這些證據(jù)并不能特異性反映自噬水平的增加，如果自噬進(jìn)程后期溶酶體功能受到抑制，也可能導(dǎo)致自噬體堆積，LC3-Ⅱ含量積累。值得一提的是，筆者發(fā)現(xiàn)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變的同時(shí)，LC3-Ⅰ的含量并沒有顯著變化，因此推測(cè)，GNA誘導(dǎo)的自噬可能并不是完整過程的自噬。此外，自噬溶酶體降解底物p62的表達(dá)增加，p62的總細(xì)胞蛋白表達(dá)水平與自噬水平呈反相關(guān)。因此筆者認(rèn)為，GNA可能有阻斷BEL-7402細(xì)胞自噬后期進(jìn)程中溶酶體的功能。加入自噬溶酶體抑制劑CQ處理后結(jié)果顯示，CQ對(duì)LC3和p62蛋白的調(diào)節(jié)作用與GNA一致，進(jìn)一步證實(shí)了GNA可能部分通過抑制自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的猜測(cè)。但是GNA的這種抑制自噬促進(jìn)細(xì)胞死亡的信號(hào)途徑有待于進(jìn)一步的研究。