梅小偉，譚 濤，肖海君，索熊熊,方六榮

[1 禮藍(lán)(上海)動(dòng)物保健有限公司，上海 200041；2 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070]

豬增生性腸炎又稱豬回腸炎，是由胞內(nèi)勞森氏菌引起的以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸上皮細(xì)胞發(fā)生瘤樣增生為特征的豬接觸性腸道疾病。自1931年首次報(bào)道該病以來，全世界主要養(yǎng)豬國家如澳大利亞、比利時(shí)、美國、日本、丹麥、泰國以及中國都有其感染和流行的報(bào)道[1-2]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。有研究表明：由于回腸炎的影響，每頭豬的成本增加2英鎊(歐洲)，感染豬與未感染豬日增重有100 g左右的差異，料肉比增加0.2～0.4，出欄期延長7 d～10 d，死亡率為1%～6%，臨床上可持續(xù)6～8周，淘汰率達(dá)15%。

根據(jù)臨床癥狀，豬回腸炎主要分為三種類型：急性型、慢性型和亞臨床型；其中急性回腸炎也稱出血性腸炎，主要發(fā)生于3～12月齡的育肥豬或后備豬，表現(xiàn)為血痢，初期糞便為暗褐色，隨即變成紅色，引起豬突然死亡；慢性回腸炎也叫腺瘤樣增生性腸炎，一般發(fā)生于6～20周齡的豬，臨床癥狀主要有腹瀉、生長緩慢、料肉比升高和豬群整齊度差，病情嚴(yán)重時(shí)殘次豬的比例大幅升高。亞臨床型回腸炎多發(fā)生于6～20周齡的豬，一般在母源抗體消失后的保育階段開始暴發(fā)，一直到育肥期的晚期。臨床上并不表現(xiàn)出腹瀉癥狀，采食量及糞便正常，但豬的生長緩慢，影響料肉比及日增重[3]。為了解豬增生性腸炎在海南地區(qū)豬場(chǎng)中的流行狀況，為其綜合防制提供科學(xué)依據(jù)，本試驗(yàn)采集海南省部分地區(qū)14家豬場(chǎng)不同日齡豬的糞便，利用PCR方法調(diào)查胞內(nèi)勞森氏菌的感染狀況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本試驗(yàn)樣品來自海南省部分地區(qū)的2家自繁自養(yǎng)母豬場(chǎng)和12家育肥豬場(chǎng)共計(jì)14家豬場(chǎng)不同年齡段豬的糞便，共計(jì)348份。

1.1.2 試劑

糞便中胞內(nèi)勞森氏菌的DNA提取試劑盒(Stool DNA Kit)為OMEGA公司生產(chǎn)，PCR檢測(cè)試劑盒由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 糞便DNA提取

按照試劑盒相關(guān)操作說明提取糞便中胞內(nèi)勞森氏菌的DNA，提取的DNA可小量分裝于-80 ℃低溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 胞內(nèi)勞森氏菌特異性序列的擴(kuò)增

采用普通的PCR方法，參考T. La等[4]推薦的方法合成1對(duì)特異性引物。胞內(nèi)勞森氏菌預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為655 bp，上游引物P1：5’-GATAATCTACCTTCGAGACGG-3’；下游引物 P2：5’-TGACCTCAGTGTCAGTTATCGT-3’。

反應(yīng)體系為25 μL：Mix 10.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，用RNase-free Water補(bǔ)至25 μL。

擴(kuò)增程序：95 ℃變性5 min；進(jìn)入PCR循環(huán)，95 ℃變性30 s，58 ℃退火90 s，72 ℃延伸120 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取胞內(nèi)勞森氏菌總DNA，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，陽性對(duì)照獲得大小為655 bp左右的片段，與設(shè)計(jì)長度一致。1～6號(hào)為部分檢測(cè)樣品，在655 bp左右有帶(圖1)，判為胞內(nèi)勞森氏菌陽性。

2.2 各豬場(chǎng)不同日齡豬的回腸炎感染情況

利用普通PCR對(duì)來自14家豬場(chǎng)的348份糞便樣品進(jìn)行了檢測(cè)，133份樣品為胞內(nèi)勞森氏菌陽性，陽性率為38.22%。14家豬場(chǎng)的糞便樣品都檢出了胞內(nèi)勞森氏菌，參檢豬場(chǎng)的陽性率達(dá)到了100%。詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果見表1。

從表1可以看出，不同豬場(chǎng)在豬群胞內(nèi)勞森氏菌感染率上存在較大的差異，陽性率最大的為9號(hào)豬場(chǎng)，達(dá)到了73.33%，最低的是4號(hào)豬場(chǎng)，為10%。在5號(hào)豬場(chǎng)，未能從4～9周齡豬的糞便中檢測(cè)到胞內(nèi)勞森氏菌，隨后逐漸檢測(cè)到胞內(nèi)勞森氏菌，說明存在感染情況，但整體陽性率不高，僅20%。不同豬場(chǎng)在生長育肥豬的陽性率高峰期上也有所不同，4～9周齡豬的陽性率為35.42%，11～20周齡豬的陽性率為37.5%，20周齡之后豬的陽性率為52%。1號(hào)豬場(chǎng)為一點(diǎn)式自繁自養(yǎng)豬場(chǎng)，生長豬群在4～9周齡時(shí)陽性率達(dá)到了50%，而母豬的陽性率為41.67%；2號(hào)豬場(chǎng)的母豬陽性率也達(dá)到了40%。這可能與不同豬場(chǎng)的管理水平和豬場(chǎng)藥物干預(yù)的水平有關(guān)。

3 討論

豬增生性腸炎對(duì)生長育肥階段的豬影響明顯，嚴(yán)重?fù)p害豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，且該病的發(fā)病率有逐漸上升的趨勢(shì)。由于該病的死亡率不高，很多時(shí)候又不容易被人發(fā)現(xiàn)，因此未能引起廣大養(yǎng)豬生產(chǎn)者的重視。本研究利用PCR技術(shù)檢測(cè)了豬糞便中的胞內(nèi)勞森氏菌，該方法特異性高，結(jié)果準(zhǔn)確，可以反映出豬群胞內(nèi)勞森氏菌實(shí)際感染情況，能夠讓各位豬場(chǎng)主客觀認(rèn)識(shí)和了解本場(chǎng)豬群的豬增生性腸炎的發(fā)病狀況，及時(shí)采取科學(xué)的防治措施，提高豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)提高對(duì)豬增生性腸炎的重視程度。

本研究檢測(cè)了14家豬場(chǎng)的348份豬糞便樣品，陽性率達(dá)到了38.22%，其中參檢豬場(chǎng)的陽性率為100%。可見，海南省部分地區(qū)的豬場(chǎng)普遍存在胞內(nèi)勞森氏菌流行情況。國內(nèi)也有學(xué)者對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的流行情況進(jìn)行了調(diào)查，如黃忠等[5]通過血清學(xué)方法對(duì)華南地區(qū)五省的豬場(chǎng)胞內(nèi)勞森氏菌流行情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)福建省和湖北省的豬場(chǎng)胞內(nèi)勞森氏菌陽性率達(dá)90%。楊小燕等[6]應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌在閩西地區(qū)豬場(chǎng)中的流行情況進(jìn)行了調(diào)查，被檢測(cè)的8家豬場(chǎng)的豬群均存在胞內(nèi)勞森氏菌，其中6～8周齡豬的陽性率為46.7%，9～13周齡生長豬的陽性率為47.8%，14～20周齡豬的陽性率為42.9%。龍星等[3]對(duì)2009-2014年間的724豬糞便份樣品進(jìn)行了檢測(cè)，共檢測(cè)出陽性樣品403份，陽性率55.66%，高于本研究的陽性率。不同年齡段的豬感染比例不一樣，保育期前期的豬感染率為22.93%，而保育期后期的豬成活率能達(dá)到45.06%，生長期豬和育肥期豬的感染率分別達(dá)到69.15%和70.58%。

豬增生性回腸炎多發(fā)生于生長育肥階段的豬，且各家豬場(chǎng)的疾病控制方案都不相同，導(dǎo)致了豬增生性回腸炎的發(fā)病率和發(fā)病時(shí)間都有差異，這為養(yǎng)豬生產(chǎn)中增生性回腸炎的防控制增加了難度。目前，我國科技人員對(duì)胞內(nèi)勞森氏菌的流行情況調(diào)查主要采用血清學(xué)的方法，本研究利用PCR技術(shù)檢測(cè)豬糞便樣品，了解了海南省不同地區(qū)的豬的流行情況，為實(shí)際生產(chǎn)和豬增生性回腸炎的防控提供了科學(xué)依據(jù)。