邢作志，張 雁

(1 甘州區(qū)畜牧獸醫(yī)工作站，甘肅 張掖 734000；2 張掖市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊(duì)，甘肅 張掖 734000)

小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起山羊和綿羊的一種急性接觸性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。本病以發(fā)病率高和死亡率高為特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展。本次試驗(yàn)主要應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA三種免疫抗體檢測(cè)方法檢測(cè)小反芻獸疫病毒的免疫抗體，以此評(píng)價(jià)小反芻獸疫疫苗的免疫效果。

1 試驗(yàn)材料

1.1 檢測(cè)樣品

血清樣品采集自甘州區(qū)轄區(qū)內(nèi)經(jīng)小反芻獸疫活疫苗免疫的羊，要求清亮且無(wú)溶血。

1.2 試驗(yàn)器材

RT-6100酶標(biāo)儀、37 ℃恒溫箱、500 mL量筒、純水儀、5 μL～50 μL單道移液器、10 μL～100 μL多道移液器、50 μL～300 μL多道移液器、配套移液槍頭、加液槽和96孔抗原抗體反應(yīng)板均為試驗(yàn)常用儀器，小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)試劑盒、間接ELISA抗體檢測(cè)試劑盒和阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、深圳真瑞生物科技有限公司和青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心。

2 試驗(yàn)方法

2.1 競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)

2.1.1 加樣

依次加入以下試劑及樣品：① 待檢血清，每份血清必須做兩個(gè)重復(fù)孔，每孔加入待檢血清樣品50 μL；②對(duì)照，每塊酶標(biāo)板上均應(yīng)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清、陽(yáng)性血清、單克隆抗體及空白對(duì)照孔，其中標(biāo)準(zhǔn)陰性血清應(yīng)設(shè)2孔，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清應(yīng)設(shè)2孔，每孔加入相應(yīng)血清50 μL，空白對(duì)照設(shè)2孔，每孔加入100 μL血清稀釋液，單克隆抗體對(duì)照設(shè)4孔，每孔加入50 μL血清稀釋液；③加單抗，將單克隆抗體用血清稀釋液進(jìn)行1∶100倍稀釋，除空白對(duì)照孔外其他各孔每孔加50 μL稀釋后的單克隆抗體。

小反芻獸疫競(jìng)爭(zhēng)ELISA抗體檢測(cè)樣品布板情況見(jiàn)圖1。

2.1.2 孵育

完成加樣后，將酶標(biāo)板置于微量振蕩器上振蕩混勻，隨后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

2.1.3 洗酶標(biāo)板加酶結(jié)合物

取出酶標(biāo)板甩干，用洗滌液(1×PBST)洗滌3次，在吸水紙上拍干，用血清稀釋液按1∶100稀釋兔抗鼠IgG-HRP結(jié)合物，每孔加入50 μL，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

2.1.4 洗酶標(biāo)板加底物溶液

取出酶標(biāo)板甩干，用洗滌液(1×PBST)洗滌3次，在吸水紙上拍干，每孔加入底物溶液50 μL，置37 ℃避光靜置顯色反應(yīng) 10 min～ 15 min。

2.1.5 加終止液并讀數(shù)

顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm值。

2.1.6 結(jié)果判定

根據(jù)公式：PI＝[1-(樣品孔的OD450nm值/單抗對(duì)照孔OD450nm值)]×100%進(jìn)行判定。

判定標(biāo)準(zhǔn)：① 當(dāng)陰性對(duì)照孔PI＜40%，陽(yáng)性對(duì)照孔PI＞60%時(shí)檢測(cè)結(jié)果成立，否則該次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效；②樣品血清PI≥45%，抗體陽(yáng)性，PI＜40%，抗體陰性，40%≤PI＜45%，則判定為可疑。

2.2 間接ELISA抗體檢測(cè)

小反芻獸疫間接ELISA抗體檢測(cè)樣品布板情況見(jiàn)圖2。

⑴ 血清稀釋：在血清稀釋板中按1∶100的體積比稀釋待檢血清，每個(gè)樣品在加入包被板前應(yīng)充分混勻。

⑵ 將稀釋好的待檢血清加入包被好的酶標(biāo)板中，每孔100 μL，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照1孔和陽(yáng)性對(duì)照2孔，每孔加入相應(yīng)的血清100 μL，蓋上封板膜，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑶ 取出酶標(biāo)板甩干，用工作濃度洗滌液洗滌4～6次，在吸水紙上拍干，每孔加入50 μL酶結(jié)合物，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑷ 取出酶標(biāo)板甩干，用工作濃度洗滌液洗滌4～6次，在吸水紙上拍干，每孔加入100 μL顯色液，置37 ℃避光靜置顯色反應(yīng)10 min。

⑸ 顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm值。

⑹ 結(jié)果判定：陰性對(duì)照的OD450nm值＜0.2，陽(yáng)性對(duì)照的OD450nm值＞0.4時(shí)試驗(yàn)成立；樣品OD450nm值/陽(yáng)性對(duì)照的OD450nm均值＝S/P值，S/P值 ≥ 0.3判為陽(yáng)性，S/P值＜0.3判為陰性。

2.3 阻斷ELISA抗體檢測(cè)

小反芻獸疫阻斷ELISA抗體檢測(cè)樣品布板情況見(jiàn)圖3。

⑴ 在陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔中加入相應(yīng)的血清，每孔50 μL，在酶標(biāo)單抗對(duì)照孔中加入50 μL稀釋液。在每個(gè)樣品孔中加入25 μL稀釋液，再加入25 μL待檢血清，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。

⑵ 取出酶標(biāo)板甩干，用洗滌液(用超純水做20倍稀釋，按5‰比例加入吐溫-20)(1×)洗滌4次，在吸水紙上拍干，用血清稀釋液按5倍稀釋酶標(biāo)單抗，每孔加入50 μL，然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min。

⑶ 取出酶標(biāo)板甩干，用洗滌液(1×)洗滌4次，在吸水紙上拍干，每孔加入底物溶液50 μL，室溫避光靜置顯色反應(yīng)10 min～ 15 min。

⑷ 顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上讀取OD450nm值，計(jì)算阻斷率。阻斷率(PB)計(jì)算方法：PB＝100-[待檢血清OD450nm值(或?qū)φ誒D450nm平均值)]×100%/Cm的 OD450nm平均值。

⑸ 對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。陽(yáng)性對(duì)照的阻斷率(PB)＞60，陰性對(duì)照的阻斷率(PB)＜40，試驗(yàn)結(jié)果有效；待檢樣品阻斷率(PB)＞50判為陽(yáng)性，待檢樣品阻斷率(PB)≤50判為陰性。

3 結(jié)果與討論

⑴ 競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA三種免疫抗體檢測(cè)方法都可對(duì)小反芻獸疫病毒免疫抗體進(jìn)行檢測(cè)，在同一塊96孔酶標(biāo)板中，競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA可以分別檢測(cè)43份、93份和90份樣品，但是競(jìng)爭(zhēng)ELISA和間接ELISA的操作相對(duì)比較復(fù)雜，且用時(shí)較多；阻斷ELISA的操作簡(jiǎn)單，用時(shí)少。如果同時(shí)檢測(cè)100份樣品，競(jìng)爭(zhēng)ELISA、間接ELISA和阻斷ELISA的準(zhǔn)確率分別為85%、88%和95%，因此阻斷ELISA的準(zhǔn)確度和重復(fù)性均高于其他兩種檢測(cè)方法，是小反芻獸疫病毒免疫抗體檢測(cè)的首選檢測(cè)方法。

⑵ 小反芻獸疫對(duì)反芻動(dòng)物的危害大，發(fā)病率和病死率通常分別超過(guò)60%和50%，該病最有效的防控手段是給動(dòng)物接種小反芻獸疫疫苗，因此，小反芻獸疫病毒免疫抗體是評(píng)價(jià)羊場(chǎng)安全及經(jīng)濟(jì)效益的最理想的指標(biāo)，選擇正確的抗體檢測(cè)方法也是重中之重。